用日本血吸虫干卵建立体外肉芽肿反应模型

中国人兽共患病杂志 1999年第2期第15卷 论　著

作者：谢可鸣　陈家旭　曹岷　夏超明　李允鹤

单位：苏州医学院基础医学部(苏州，215007)

　　关键词： 日本血吸虫；干卵；脾细胞；肉芽肿；体外模型

　　摘　要　目的　在体外建立一种与血吸虫感染宿主组织内病变相似的虫卵肉芽肿反应模型以便对该病变的形成机理作进一步研究。方法　将日本血吸虫干卵悬液分别加于感染组、虫卵免疫组和正常对照组小鼠脾细胞培养物中，诱导这些脾细胞对虫卵的附着等反应，对影响反应强度的部分因素进行观察。结果　感染组和免疫组的脾细胞反应均显著强于正常对照组者，感染组的反应较免疫组者更早出现且更显著。结论　采用日本血吸虫干卵和感染鼠脾细胞在体外建立虫卵肉芽肿反应模型简便可行。

ESTABLISHMENT ON GRANULIOMA REACTION MODEL IN VITRO WITH

　　DRY EGGS OF SCHISTOSOMA JAPONICUM

Xie Keming　Chen Jiaxu　Cao Min　Xia Caomin　Li Yunhe

　　(Department of Basic Medicine.Suzhou Medical College，Suzhou，215007)

　　ABSTRACT　Aim　To establish a model of egg granuloma reaction in vitro similar to the pathologic changes in the tissues of schistosome-infected hosts for further strdies on formation mechanisms of egg granuloma.Method　The suspension of Dry eggs of Schistosoma japonicum was added to the culture of the spleen cells from mice in schistosome-infected，living eggs immunized and control groups respectively to induce these cells to produce reactions of adherence to eggs，etc.The intensity of granuloma reaction was determined according to the number of those cells adhering to egg.Some factors affecting the intensity were observed.Results　The cell reactions of infected and immunized groups were both significantly stronger than those of contro groups.The splenocyte reactions of immunized mice not only occurred earlier but also were more remarkable.Conclusion It is convenient and feasible to utilize dry eggs of Schistosome japonicum and spleen cells of infected mice to establish the model of granuloma reactions in vitro.

　　KEY WORDS　Schistosoma japonicum　Dry egg　Splenocyte　Granuloma　model in vitro

　　开展对血吸虫病虫卵肉芽肿病变形成和免疫调节机理的研究，对于指导抗病免疫有重要意义。实验研究中往往要先建立病变的模型。常用方法是以血吸虫尾蚴感染实验动物及直接将虫卵或载有虫卵抗原的微粒注入致敏动物的静脉，从而在相应脏器诱发病变。Doughty和Phillips应用体外培养技术，将曼氏血吸虫活卵与感染鼠脾细胞共同培养，建立了一种不同于上述模型的体外虫卵肉芽肿反应模型，将其用于曼氏血吸虫卵肉芽肿形成机理的研究并与动物体内病变作平行对照，取得了进展^［1］。然而，类似方法在日本血吸虫病的研究中尚未见到应用。由于日本血吸虫卵肉芽肿病变机理至今尚不完全清楚，建立和应用类似的体外模型进行研究确有必要。为此，本文首次以日本血吸虫干卵为抗原材料诱导感染及免疫鼠脾细胞，建立了体外虫卵肉芽肿反应模型。现将研究报告如下。

　　1　材料和方法

　　1.1　实验动物　体重为18～20g的健康雌性ICR小鼠购自中科院上海实验动物中心。将之随机分为感染和对照两组。自江苏省寄生虫病研究所购得阳性钉螺。按常规经腹壁给予感染组小鼠感染新鲜逸出的日本血吸虫尾蚴30条，对照组不予感染。

　　1.2　免疫小鼠　取感染后6w的ICR小鼠5只，处死，取肝参考文献方法^［2］分离活卵并用0.01MpH7.4的PBS配成8000／ml的虫卵悬液，给正常ICR小鼠作背部多点皮下注射，每鼠0.25ml。一周后取按同法再次自感染后6wk鼠新分离的肝卵悬液，给初次免疫鼠作尾静脉注射以加强免疫，每鼠注卵约2000个。

　　 1.3　反应模型的建立　从待观察的各组随机各取小鼠3～6只，按已建方法^［3］获得经溶血处理后的脾细胞悬液。根据需要调整细胞密度，每只鼠的悬液都分数份分别加到数块24孔培养板(Nunclone)孔中，将板置于37℃的CO₂培养箱中培养，15～20h后，向各孔加虫卵悬液20～25μl后继续培养和观察。实验中使用RPMI1640(Gibco)完全培养基，其中小牛血清含量为15％，Hepes浓度为25mM。

　　1.4　虫卵　培养中加入的日本血吸虫干卵购自江苏省寄生虫病研究所，除用于不同批号干卵比较时加用批号为800630的1980年制品外，余均用批号为961105的制品并均置4℃冷藏。自安瓿取出的干卵经0.01MpH7.4的灭菌PBS离心洗涤5遍后，用培养液调整到所需密度，置4℃冷藏。培养中加入的鲜活卵系临用前同上法自感染后7w鼠肝脏分离。

　　1.5　反应结果的确定　在加卵培养后不同时间，用倒置显微镜(Olympus)观察脾细胞围绕虫卵等的反应情况，并沿培养板孔最大横径横向顺序观察并记录孔底单个散在的虫卵周缘脾细胞附着反应情况，每孔计数50个卵。根据附着的细胞数分级确定肉芽肿反应的强度：1)无细胞附着；2)局部有1～5个细胞附着；3)局部有6～10个细胞附着；4)局部有11个以上细胞附着；5)整个虫卵周缘附有一层细胞；6)整个虫卵周缘附着的细胞超过一层。小鼠脾细胞对50个虫卵反应强度的平均值即为该鼠的反应指数(RI)。组间反应指数平均值差异的统计分析用t或F检验。

　　2　结　果

　　2.1　鲜活卵、新鲜干卵及长期冷藏的干卵诱导效果　用感染后7w的小鼠脾细胞作实验，于加卵后第5天观察结果。显示鲜活卵、1996年新鲜制备的干卵及长期冷藏的1980年制备的干卵各自诱导同一组脾细胞产生的RI均值分别为4.18±0.78、4.55±0.63和4.51±0.41，三组均值间未见显著性差异。

　　2.2　脾细胞密度、虫卵密度及虫卵悬液保存时间对RI的影响　用感染后11～14w的小鼠脾细胞进行实验，加卵后第5天观察结果。显示：培养时随脾细胞密度的成倍增加，肉芽肿反应也逐渐增强(图1)，细胞密度的对数值与反应指和呈显著(P＜0.025)直线相关、r=0.96；当脾细胞密度为2×10⁶／ml、用新鲜干卵现配悬液时，肉芽肿反应强度并不随虫卵密度增加而持续增强(表1)；干卵悬液配好后，延长保存时间，虫卵的诱导效应相应降低，。同时用现配的干卵悬液、配好后冷藏14d和21d的干卵悬液各自诱导产生的RI均值分别为3.90±0.17、3.49±0.47和3.30±0.30，存放21d后虫卵悬液的诱导效果显著弱于用时现配者。

图1　感染鼠脾细胞密度对反应指数的影响

　　Figl.Effect of density of spleen cells from infected mice on reaction index.

表1培养时虫卵密度对反应指数的影响

　　Table 1.Effect of gee density on reaction index during culture

*以每ml培养液中的虫卵数表示Expressed in egg number per ml culture

　　2.3　培养期间感染鼠脾细胞对干卵反应的动态　用感染后10～12w小鼠实验。加卵后12h内脾细胞对虫卵无明显反应，加卵后1～2d，可见到巨噬细胞和粒细胞致密地附着或包围虫卵，加卵后5～6d，附着虫卵的细胞群中粒细胞消失，主要为大的单个核细胞(包括巨噬细胞和淋巴细胞)有的可见到葡萄串样的淋巴细胞克隆，附着的巨噬细胞伪足明显。游离相中有大量增生的淋巴细胞，巨噬细胞的吞噬活动及细胞融合过程易见。与之相对照，同期正常鼠脾细胞对虫卵反应低下，仅少量虫卵上附有数个粒细胞或／及个别巨噬细胞，极大多数的胞质变粗或细胞崩解，未见淋巴细胞的增生。加卵后10d内脾细胞对虫卵的RI平均值在感染组和正常对照组间差异显著，P＜0.002～0.05(图2)。

图2　培养期间感染鼠脾细胞反应指数的动态

　　Fig2.Kinetics of reaction index of spleen cells from infected mice during culture in vitro after adding eggs.

　　2.4　培养期间免疫鼠脾细胞对干卵反应的动态　免疫鼠脾细胞的反应与正常对照鼠者早期差别不大，但随培养时间延长免疫鼠脾细胞RI逐渐升高，胞质透亮度增加，加卵后5d时其RI已显著高于正常对照组者(P＜0.05)，加卵后8d时，P＜0.001。虫卵附着细胞以单核巨噬细胞为主，可见到淋巴细胞克隆。

图3　培养期间免疫鼠脾细胞反应指数的动态

　　Fig3.Kinetics of reaction index of spleen cells from immunized mice during culture in vitro after adding eggs.］

　　3　讨　论

　　日本血吸虫卵的干卵制品经常作为环卵沉淀试验(COPT)的抗原用于血清学诊断，直接将其用于体外培养及细胞免疫学研究尚属首次。本文在建立虫卵肉芽肿反应的体外模型时，首先比较了干卵和自急性血吸虫病小鼠肝脏分离的鲜活卵的诱导效果，结果显示这两种卵在诱导同一批感染鼠脾细胞的肉芽肿反应时，反应强度间未出现显著性差异；长期冷藏也未影响干卵的诱导效果；感染鼠及虫卵免疫鼠脾细胞对干卵的反应均显著强于同期正常鼠者。这些结果提示，在建立围绕日本血吸虫卵的肉芽肿反应模型时，用干卵作为抗原颗粒代替鲜活干卵是简便、稳定和可行的。进一步实验的结果还表明，用干卵建立虫卵肉芽肿反应的体外模型时，脾细胞密度在2×10⁶／ml、干卵悬液现配、虫卵在培养物中的终密度在250～500／ml是适宜的。

　　对同一批干卵的刺激，感染鼠与免疫鼠的脾细胞各自呈现不同的反应。感染鼠脾细胞反应迅速，早期以粒细胞和巨噬细胞为主，很快又出现淋巴细胞显著增生等反应，较接近于宿主体内病变的情形；而免疫鼠脾细胞则反应缓慢，参与反应的细胞主要为巨噬细胞，淋巴细胞增生较弱。其原因可能与这两种鼠脾细胞中已被虫卵抗原致敏的淋巴细胞克隆数及其细胞量在脾细胞总体中占比重不同有关。正常对照鼠脾细胞群体中缺少必要量的致敏淋巴细胞，因而对虫卵的反应显著弱。

　　日本血吸虫卵肉芽肿的形成主要也与细胞介导的免疫应答有关^［4，5］。本实验的观察结果为此提供了有力的旁证。但本文所建立的反应模型尚待与活卵模型及宿主体内病变进行更详细的动态的平行对比，体外反应中各种反应细胞的性质、反应顺序及相互关系也待进一步深入观察，宿主感染后不同阶段其免疫细胞对虫卵的反应有何规律等有待探讨。总之本反应模型的建立无疑为进一步研究和阐明虫卵肉芽肿病变机理等提供了有益的工具，因而具有重要的理论和实际意义。

　　4　参考文献

　　1.Doughty BL，et al.Delayed hypersensitivity granuloma formation around Schistosoma mansoni eggs in vitro.I.Definition of the model.J Immunol，1985，128(1)∶30.

　　2.李允鹤主编.寄生虫病免疫学及免疫诊断.南京：江苏科学技术出版社，1991，342.

　　3.谢可鸣，等.中药“425”对血吸虫卵肉芽肿病变免疫调节作用的机理研究.中国人兽共患病杂志，1994，10(6)∶15.

　　4.Cheever AW，et al.Immunopathology of Schistosoma japonicum infection in athymic mice.Parasite Immunol，1985，7(4)∶387.

　　5.Cheever AW，et al.Immunopathology of Schistosoma japonicum and Schistosoma mansoni infection in B cell depleted mice.Parasite Immunol，1985，7(4)∶399.

1998年2月12日收稿