日本血吸虫成虫抗原合并蚯蚓抗原对小鼠胸腺淋巴细胞及亚群的影响

中国人兽共患病杂志 1999年第4期第15卷 实验研究

作者：姜昌富　贺宇飞　于　爽　孙　焱

单位：同济医科大学人体寄生虫学教研室（姜昌富）；同济医科大学第二临床学院（贺宇飞　于　爽　孙　焱）

　　关键词： 日本血吸虫；可溶性成虫抗原；蚯蚓抗原；胸腺淋巴细胞

　　摘　要　BALB/c小鼠经可溶性日本血吸虫成虫抗原（SWAP）或/和可溶性蚯蚓抗原（SEWP）免疫后，观察、计数其胸腺T细胞总数、活性T细胞、L₃T₄细胞以及L_yt₂细胞。结果显示，SWAP免疫组L₃T₄细胞明显增加（P＜0.05）；SEWP免疫组4个指标则均无明显变化（P＞0.05）；SWAP与SEWP混合制剂免疫组T细胞总数、活性T细胞以及L₃T₄细胞均显增加（P＜0.05）。相关分析表明：CD⁺₄T细胞（即L₃T₄细胞）在SWAP所诱导的保护性免疫力中可能起重要作用，而SEWP存在细胞免疫以外的其它可能保护性免疫机制，但SEWP与SWAP有明显的协同作用。

EFFECTS OF SCHISTOSOMA JAPONICUM WORM ANTIGEN

　　AND SUBPOPULATION IN MICE

Jiang Changfu He Yufei Yu Shuang et al

(Department of Parasitology,Tongji Medical University,Wuhan,430030)

　　ABSTRACT To investigate Total thymocytes,active thymocytes,L₃T₄ cells and Lyt₂ cells in BALB/c mice after being immunized with soluble S.japonicum worm antigen preparations(SWAP) or/and soluble earthworm preparations(SEWP).L₃T₄ cells were significantly increased in SWAP immunized group(P＜0.05).No obvious changes happened in SEWP group.While total thymocytes,active thymocytes and L₃T₄ cells were all significantly increased (P＜0.05)in SWAT-SEWP jointly immunized group.The results suggest that CD4⁺ cells(i.e.L₃T₄ cells) might play an important rele in the protective immunity elicited by SWAP,whereas SEWP have other possible protective immunity mechanisms.but there is obvious synergism between SEWP and SWAP.

　　KEY WORDS Schistosoma japonicum Soluble worm antigen Earthworm antigen Tymocyte

　　日本血吸虫虫体抗原（SWAP）免疫小鼠后可诱导其产生明显的抗攻击感染的保护作用^［1］。据Wisnewski等（1995）^［2］报道，可溶性蚯蚓抗原（SEWP）亦可诱导小鼠产生36％的抗日本血吸虫再感染的保护力。本文分别以SWAP、SEWP以及SWAP与SEWP的混合制剂免疫BALB/c小鼠，观察胸腺T细胞及其亚群的变化，以探讨这些免疫原诱导保护力的可能机制。

　　1　材料与方法

　　1.1　抗原制备　可溶性日本血吸虫成虫抗原（SWAP）以及可溶性蚯蚓抗原（SEWP）的制备参照Wisnewski等（1995）^［2］提及的方法，最后调整蛋白含量为20μg/ml。SWAP与SEWP的混合制剂由两者等量混合。

　　1.2　动物与分组　BALB/C纯系小鼠41只，1～3组为免疫组，各10只，分别皮下注射SWAP、SEWP、SWAP与SEWP混合制剂各100μg/只，第4组为正常对照，共11只。免疫组每隔1周以同样剂量免疫1次，共3次。

　　1.3　胸腺T淋巴细胞及其亚群观察

　　1.3.1　胸腺细胞总数的测定：最后一次免疫1周后同时摘取四组小鼠胸腺，加Hank′s液，以组织匀浆器研碎，200目尼龙筛过滤，取滤液1500g/min离心3min，弃上清液，取沉淀加Tris-NH₄Cl作用2～5min，离心1500g/min,3min，弃上清液，取沉淀，加Hank′s液2ml，取50μl加2％台盼蓝50μl，室温染色10min后，加入细胞计数板中，细胞总数为：4大格细胞总数÷4×10⁴×稀释倍数。

　　1.3.2　胸腺细胞活性测定　操作方法基本同前，在计数板上共计数200个细胞，并计算其活性细胞百分率，不着色细胞为活性细胞。

　　1.3.3　胸腺淋巴细胞亚群测定　将制备的胸腺细胞制成1×10⁶个/ml细胞悬液，加入94孔培养板中，10μl/孔，再分别加入大鼠抗小鼠L₃T₄（TH）和L_yt₂(TS)的M_cA_b（由北京帮定生物医学公司提供）各20μl/孔，混匀，37℃水浴温育30min，加入1∶5豚鼠补体20μl/孔，37℃水浴温育30min，加1％伊红Y和0.8％戊二醛15μl/孔，混匀后，滴在载玻片上，于光镜下每孔计数200个细胞，并计算阳性细胞百分率（即着色细胞）。

　　2　结果

　　2.1　SWAP免疫组　T细胞总数、活性T细胞以及L_yt₂细胞均较正常组无显著增加（P＞0.05）；而L₃T₄细胞则明显增加（P＜0.05）。

　　2.2　SEWP免疫组　与正常组比较，T细胞总数、活性T细胞以及L_yt₂细胞均减少，而L₃T₄细胞则有所增加，但均无显著差异（P＞0.05）。

　　2.3　SWAP与SEWP混合制剂免疫组　与正常组比较，T细胞总数明显增加（P＜0.05）；活性T细胞显著增加（P＜0.01）；L_yt₂细胞有所减少，但无显著差异（P＞0.05）；L₃T₄细胞显著增加（P＜0.001）。

　　各免疫原免疫小鼠后其胸腺淋巴细胞及亚群变化详见表1。

表1　不同免疫原对小鼠胸腺T细胞及亚群的影响

　　Table 1 Effects of different immunogens on thymocgtes and subpopulation in mice

　　sWAP:可溶性日本血吸虫成虫抗原　SEWP:可溶性蚯蚓抗原　SWAP+SEWP：SWAP与SEWP混合制剂　*经t检验与正常对照组比较3　讨论

　　不少研究表明，T淋巴细胞在血吸虫疫苗的保护性免疫机制中起重要作用^［3～5］。本实验用SWAP免疫小鼠后，胸腺CD⁺₄T细胞（即L₃T₄细胞）明显较正常组增加，而CD⁺₈T细胞（即L_yt₂细胞）无明显增加，表明CD⁺₄T细胞在SWAP所诱导的保护性免疫机制中可能发挥重要作用。这与石佑恩等（1996）^［3］和Vignali等（1989）^［4］用减毒尾蚴免疫小鼠后，在腋窝淋巴结观察到的结果基本一致。

　　有意义的是用SEWP单独免疫小鼠后，所测胸腺T细胞4个指标均无显著变化，提示SEWP免疫小鼠后细胞免疫反应较弱。但事实上SEWP可诱导36％的抗日本血吸虫攻击感染的保护力^［2］，SWAP与SEWP合亻　并免疫小鼠可诱导48.75％的抗日本血吸虫攻击感染的保护力^［9］。因此SEWP所诱导保护力的机制可能是非依赖T淋巴细胞的，而存在其它的机制。

　　事实上，淋巴因子激活巨噬细胞而发挥其杀伤功能在日本血吸虫保护性免疫机制中起一定作用^［5］，而体液免疫和NK细胞则起重要作用^［6］。Vignali等（1989）^［4］用减毒尾蚴多次免疫小鼠后可诱导有效的体液免疫的保护作用，而不需T细胞参与。Capron等在感染宿主研究中支持IgE依赖性杀伤作用为主的保护性免疫机制，参与的效应细胞为非淋巴细胞，包括嗜酸性粒细胞、单核巨噬细胞和血小板^［7］。

　　基于以上这些认识以及本文的研究，SEWP所诱导的保护性免疫机制可能是：1.体液免疫，即抗体对单核巨噬细胞的调整作用和/或抗体依赖的嗜酸性粒细胞介导的细胞毒作用；2.NK细胞的作用；3.其它机制。至于到底是何机制，有待进一步研究。但不能完全排除T细胞的作用，因为毕竟本实验用SEWP免疫小鼠后CD⁺₄T细胞有所增加。而CD⁺₄T细胞有促进B细胞及其它免疫细胞增殖与分化的作用^［8］。而且SEWP与SWAP存在分子量为40、74、97、＞110kDa的共同抗原分子^［2］，因此SEWP与SWAP所诱导的保护性免疫机制中应该存在共同点。此外，值得一提的是，SEWP的这种尚未明确的诱导保护性免疫的机制，也为我们指出一条寻找新疫苗的途径，即存在多种有效保护性免疫机制而不仅是细胞免疫机制为主的血吸虫疫苗。

　　本实验在用SWAP与SEWP的混合制剂免疫小鼠后，发现除CD⁺₈T细胞较正常组减少外，T细胞总数、活性T细胞以及CD⁺₄T细胞均明显增加，这可能是SEWP与SWAP有协同作用，因为单独用SEWP免疫小鼠时，其T细胞总数及活性T细胞甚至是较正常组减少的。综合前面的分析，这种协同作用可以解释为：1.SEWP与SWAP存在共同的抗原成份；2.SEWP免疫后诱导的保护性免疫机制对SWAP所诱导的细胞免疫有增强作用；3.亦有可能是SWAP所诱导的细胞免疫增强了潜在的SEWP可能诱导的细胞免疫反应；4.SEWP还起到了佐剂的作用。据Maddison认为，SWAP与佐剂BCG同时免疫时，BCG的作用可能是通过激活T淋巴细胞或巨噬细胞而杀灭正常入侵的童虫^［1］，那么，SEWP与SWAP同时免疫小鼠时，SEWP是否还起到类似BCG的作用，有待更进一步研究。

　　参考文献

　　1.蒋明森，等.日本血吸虫虫体抗原导致的保护性免疫及其免疫特征的分析.中国寄生虫病防治杂志，1993，6（4）：269.

　　2.Wisnewshi AV,et al.Induction of protective immunity to schistosomasis with immunologically cross-reactive Lumbriucs molecules.Int J Paras,1995,25(4):503.

　　3.石佑恩，等.日本血吸虫和曼氏血吸虫减毒尾蚴免疫小鼠淋巴细胞表型的动态.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1996，14（4）：262.

　　4.Vignali DAA,et al.A role for CD⁺₄ but not CD⁺₈ T cells in imm unity to Schistosoma mansoni induced by 20 krad-irradiated and Ro 11-3128-terminated infections.Immunology.1989,67:466.

　　5.武华，等.日本血吸虫保护性免疫机制研究细胞免疫应答.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1993，11（1）：41.

　　6.吕芳丽，等.紫外线减毒日本血吸虫尾蚴免疫小鼠的体液免疫和NK细胞活性的动态变化.中国寄生虫病防治杂志，1996，6（2）：93.

　　7.姜小山，等.血吸虫疫苗的研究现状与展望.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1997，15（2）：111.

　　8.龙振洲主编.医学免疫学.北京：人民卫生出版社，1996，86.

　　9.周建宁等.5种日本血吸虫疫苗佐剂的比较研究.中国人兽共患病杂志，1999，15（2）：21.