分子生物学方法研究血吸虫种株遗传变异及分类应用进展

中国人兽共患病杂志 1999年第6期第15卷 综述

作者：冯友仁

单位：同济医科大学寄生虫学教研室（武汉，430030）

冯友仁(综述)　牛安欧(审校)

　　血吸虫种株差异导致对钉螺感染率、感染度及幼虫—钉螺相溶性，尾蚴逸出周期，对药物敏感性，在终宿主内发育、排卵、潜伏期、免疫及致病等方面均存在一定差异^［1］。故血吸虫种株差异及分类研究对其流行病学及血吸虫控制防治和疫苗的发展具有重要意义。传统的血吸虫分类主要依据虫卵形态，中间宿主地理分布，交叉繁殖及生理生化等参数^［2］，这些方法随着对血吸虫种群认识的深入，其局限性日益明显。由于自然地理环境等生态环境因素长期影响，血吸虫种株之间存在不同程度遗传分化，这些变化用传统的方法很难加以区分。后来的蛋白质和酶学方法对血吸虫种株研究取得一定的成果^［3］。但是蛋白质和酶都是基因表达产物，而非基因本身，这些物质有可能是在翻译后修饰或加工而成，而不能真正反映种株基因变异情况。应用基于DNA的分子生物学方法研究血吸虫遗传变异和分类，能直接反映基因本身，显示出上述方法无可比拟的优越性。本文就近年来这方面的有关研究作一综述。

　　1　特异性核酸探针杂交技术

　　通常同种生物具有相同的DNA序列，这种序列是相对稳定的，由于缺失、插入、扩增、倒位及突变等原因引起基因DNA序列的改变。找出基因特异性DNA片段予以标记作为探讨，根据核苷酸碱基变性复性，顺序互补原理进行核酸杂交，然后通过探针上标记物及信号放大系统进行检测。探讨只与其具有同源性的核酸杂交，因而具有敏感性高、特异性强的特点。这种方法已较早应用于血吸虫种株基因及分类研究。

　　Mccutchan^［4］,Walker^［5］,Spotila^［6］和Merta^［7］等分别用克隆的曼氏血吸虫rDNA基因片段制成探针pSM389,pSM889和pSM890，通过Southern blot分析血吸虫DNA，并进行种株分类和性别鉴定。Webster等^［8］用高重复的雌虫特异性DNA探针pW₁鉴别血吸虫尾蚴性别，pW₁与同位素标记的日本血吸虫雌雄虫杂交程度不同，W₁片段与梅氏血吸虫、杜氏血吸虫及埃及血吸虫雌雄虫DNA无杂交，仅与曼氏血吸虫雌虫杂交。曾宪芳等^［9］用pSM889和pSM389探针研究曼氏血吸虫和日本血吸虫DNA，表明两种血吸虫之间及中国大陆6个地域株之间均有不同程度差异。Minchella等^［10］发现探针pSM750能快速鉴别14个不同曼氏血吸虫地域株。He等^［11］以pSM889探针对日本血吸虫5个地域株DNA进行分析，发现DNA主带一致，次带相异。

　　特异性DNA探针杂交方法能有效分辨血吸虫种株差异，甚至性别差异也能鉴别，因而应用较广，但此方法操作复杂，如用同位素标记还存在放射性污染。

　　2　核酸限制性酶切片段长度多态性(RFLP)

　　DNA限制性核酸内切酶是一类能识别DNA链内特定核苷酸序列，并切割DNA双链的酶类。不同种株血吸虫DNA序列不同，使得识别切割特异核苷酸限制性内切酶从不同位点切割DNA，产生不同酶切片段，电泳后酶切片段分开形成限制性片段长度多态性(Restr iction fragment length polymorphism,RFLP)图谱。通常选用适当DNA探针通过Southern印迹杂交，比较不同种株之间重复DNA的RFLP差异，从而反映它们之间基因序列差异。RFLP分析血吸虫种株差异十分有效，并可测序种系发生关系。

　　Rollinson等^［12］用内切酶切割曼氏血吸虫和其它6种血吸虫DNA，产生酶切片段，再通过转移杂交，显示出各虫种之间的差异。Viera等^［13］研究美洲不同地域株曼氏血吸虫rDNA基因RFLP，显示出各地域株之间差异。罗雄等^［14］用三种限制性内切酶分析中国大陆3地域株日本血吸虫DNA的RFLP，同样显示地域株差异。谢觅等^［15］对中国大陆5地域株雄虫DNA经酶切后与pSM889探针杂交，结果强杂交带相同，而弱杂交带相异。对中国大陆与台湾及日本山犁不同地域株日本血吸虫DNA进行RFLP分析，证明它们存在差异^［16］。

　　RFLP技术虽能区分种间种内基因差异，但是由于操作复杂，费时，需大量DNA，因而没有常规使用。

　　3　核酸序列测定

　　测定核酸DNA序列是种株基因分析的重要技术。通过测定DNA序列可以得到最完整的物种系统发生资料，基因组中某一区域，一级DNA序列可作为鉴别基因型标志。核酸序列测定能详细分析基因结构和功能，RFLP和探针只能比较某一特异遗传特征差异，而测序则能深入DNA分子水平上揭示物种之间遗传特征差异，以及它们之间进化和亲缘关系，同时为特异探针和PCR提供先决条件。

　　血吸虫DNA测序目前主要集中于rRNA基因复合体和线粒体的研究。由于rRNA的编码基因包括高度保守和高度可变不同进化速率区域，利于序列分析及比较；而高度遗传、快速演化的线粒体DNA(mtDNA)适合于遗传变异研究。rRNA是最早从血吸虫基因组中克隆并广泛用于研究种间种内变异^［17］。1991年由Omer等^［18］完成18S rRNA基因序列测定。对血吸虫属内的埃及血吸虫、日本血吸虫、梭形血吸虫及曼氏血吸虫的基因变异区分析，发现种内除螺旋段E21-1至E21-5高度变异外，其余都是高度保守的，表明埃及血吸虫与梭形血吸虫是近似姐妹种，而日本血吸虫与它们关系疏远^［19］。卵壳蛋白和28kDa GST酶基因序列在血吸虫是近似姐妹种，而日本血吸虫与它们关系疏远^{［20， 21］}。Blair等^［22］根据DNA序列推测马来血吸虫与其它亚洲血吸虫关系，通过核糖体内转录间隔区ITS₁、ITS₂和线粒体细胞色素氧化酶亚单位1（CO1）基因的DNA序列比较日本血吸虫与湄公血吸虫和马来血吸虫之间关系。Johnston等^［23］用7种血吸虫rRNA大亚基D₁和小亚基V₄区基因序列进行种系分类。Littlewo od等^［24］用28SRNA基因序列D₁、D₂和D₃ 3个区域研究4种血吸虫 基因差异，并绘制种系发生图。Depres等^［25］研究血吸虫线粒体DNA序列，发现mtDNA序列分析血吸虫种株基因研究很有意义。

　　DNA序列测定，技术复杂，设备要求较高，因而只适合于有条件的实验室研究。

　　4　基于PCR的方法

　　聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)是一种体外合成DNA技术，能从少量样本中在极短时间内扩增出大量纯度极高的目的DNA片段，并进行检测。此方法具有操作简便、快速、特异和敏感的特点，是研究物种遗传变异及分类的好方法。

　　4.1　一般PCR　先设计特异性引物对特定基因进行扩增，然后对PCR扩增产物直接进行研究，这是PCR常用方法。Bowles等^［26］用PCR扩增血吸虫线粒体CO1基因，发现曼氏血吸虫、日本血吸虫和埃及血吸虫之间存在明显差异，而两株日本血吸虫之间基本相同。Sanchez等^［27］按曼氏血吸虫121bp重复序列设计引物，用PCR研究3个不同地域株曼氏血吸虫，显示多态差异。

　　4.2　PCR-RFLP　此方法是先用PCR扩增DNA，再经上述的RFLP分析。与传统RFLP相比，PCR-RFLP所需DNA量大为减少，而且质量要求也不太高。

　　4.3　PCR-SSCP　聚合酶链反应—单链构象多态性(PCR-Single strand confo rmation polymorphism,PCR-SSCP)系将PCR产物变性成单链DNA片段，再在分辨率较高的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色观察结果。由于单链DNA内碱基配对具有一定空间构象，当DNA链上碱基发生改变时，就会形成不同的构象，称单链构象多态性(SSCP)。不同构象的DNA分子在非变性聚丙烯酰胺凝胶中具有不同的泳动速率，如果DNA片段内有突变，即便是单个核苷酸有差别，构象也不相同，会产生不同泳动速率，从而将它们区分开来。Orita等^［28］认为SSCP能检测DNA多态性及点突变，是一种比RFLP更好的方法。

　　肖建华等^［29］根据日本血吸虫DNA分子上一段280bprRNA序列设计一对引物，用PCR-SSCP分析中国大陆4个不同地域株日本血吸虫多态性差异，结果湖北湖南为一类型，而云南、江苏为另一类型。

　　以上PCR方法，引物设计需建立在已知基因序列信息之上，给特异引物设计增加了难度，而且要避免DNA污染，有其局限性。

　　4.4　随机扩增多态性DNA（RAPD）技术　随机扩增多态性DNA技术 (Random amplified polymorphic DNA,RAPD)是由William等^［30］和Welsh等^［31］发展的一种基于PCR的基因分析方法，Welsh称之为任意引物PCR(Arbitrary primer-PCR,AP-PCR)。其原理是以一条短而非特异性随机寡核苷酸序列作引物，与模板DNA进行PCR反应，该引物与模板基因组多个位点结合，造成未知名区域扩增。不同物种基因组经随机引物扩增后产生的DNA片段显示不同的指纹图谱，称之为多态性。一旦物种基因序列发生改变，所扩增出的多态性指纹图谱就发生相应变化。此技术不同于传统的PCR，其引物短，扩增条件不太严格，镁离子浓度高，这些有利于在庞大基因组中找到基本互补区段并与之结合。RAPD除具有一般PCR的简便、快速及安全的优点外，还由于其引物的随机性克服了特异引物设计上的困难，从而提高了研究效率，是物种鉴定分类及流行病学调查的好方法。为明确种间亲缘关系需使用大量引物^［32］，实验条件的细微差异造成指纹图谱难以重复性^［33］，这是其局限性，随着标准化引物使用及标准化操作，这些缺点有望克服^［34］。

　　RAPD已较多地用于血吸虫遗传学及分类学等领域研究。Neto等^［35］首先用RAPD对8种血吸虫和5株曼氏血吸虫进行分析，表明有些引物可用于种间分类，而另一些引物可用于种内虫株分类，它们分别在种株间呈现RAPD指纹图谱多态性差异。Bowles等^［36］研究中国株和菲律宾株日本血吸虫及湄公血吸虫，结果两种血吸虫之间有差异，而两株日本血吸虫无差异。Barral等^［37］用50个引物研究5种血吸虫及3株曼氏血吸虫多态性差异，有些引物还在雌雄虫之间表现多态差异，作者还就此绘制了血吸虫种系发生图。Kaukas等^［38］用4种引物进行RAPD分析，证实4株间插血吸虫、3株埃及血吸虫及2株曼氏血吸虫分别为3个独立种系，羊血吸虫和S.leipri为另一独立种，系统发生树提示马氏血吸虫是唯一能产生与日本血吸虫相似具有侧剌虫卵的非洲血吸虫。Simpson等^［39］用RAPD研究血吸虫及中间宿主也取得较好效果。而Pereira等^［40］用RAPD法对耐药和敏感株曼氏血吸虫DNA进行基因分析，没有发现它们之间有明显差异。

　　RAPD技术取得的许多研究成果已证明此项技术对血吸虫种株乃至性别研究是十分有效的，随技术不断完善，操作规范化及标准化，此技术具有很大的开发潜力。

　　4.5　简单重复序列锚定PCR(SSR-PCR)　简单重复序列锚定PCR(Simple sequence repeat-anchored PCR amplification,SSR-PCR)是基于微卫星DNA(microsatellite DNA)研究而发展的新技术。微卫星亦称简单重复序列或短串联重复序列，是1-6个碱基作核心，单位串联重复排列而成为的一类DNA序列，由于该序列种类多，分布广，高度多态， 因而很快成为核酸基因遗传标志而广为应用^［41］。SSR-PCR就是针对高度密度重复序列，设计与之互补寡核苷酸作单引物扩增其重复片段，揭示其多态性。Zietkiewicz等^［42］用SSR-PCR研究不同真核生物取得很好的多态性差异。Olivera等^［43］对2株曼氏血吸虫进行SSR-PCR分析，所得结果与RAPD和RFLP一样显示较好的多态性差异。

　　SSR-PCR具有RAPD优点外，而且重复稳定性好，且多种物种及虫株只需一种引物，这大大简化了研究种株差异及分类进程。基于微卫星DNA的SSR-PCR是研究血吸虫等基因信息的新技术，并可望成为寄生虫分子流行病学十分有用的工具。

　　5　结语

　　用分子技术从基因分子水平研究血吸虫物种分类、进化及亲缘关系，揭示种株之间遗传变异本质，为血吸虫病控制及疫苗研究提供依据，更新更好的分子技术将会用于血吸虫基因研究。

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1998年11月20日收稿