日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因在大肠杆菌的表达

中国人兽共患病杂志 1999年第5期第15卷 论 著

作者：田生和　段　凯　赖建平　王大坤　郑　宏　石　磊

单位：卫生部武汉生物制品研究所(武汉，430060)

　　关键词： 日本血吸虫；脂肪酸结合蛋白；PCR；基因克隆；疫苗

　　摘　要　目的　克隆并表达日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因以制备血吸虫疫苗候选分子。方法　利用 PCR 技术扩增日本血吸虫大陆株的 cDNA 基因，经 BamHI 和 EcoRI 双酶切后定向克隆于原核表达质粒 PEGX2-T,并在大肠杆菌进行表达研究。结果　获得目的基因克隆，在大肠杆菌可诱导表达约 44kD 的融合蛋白，该重组抗原能被慢性血吸虫病人血清特异性识别。结论　成功地表达了一种血吸虫疫苗候选抗原，为进一步研究打下基础。

GENE EXPRESSION OF FATTY ACID-BINDING PROTEIN FROM

　　SCHISTOSOMA JAPONICUM IN ESCHERICHIA COLI

Tian Shenghe　Duan Kai　Lai Jianping　Wang Dakun　Zheng Hong　Shi Lei

(Wuhan Institute of Biological Products,Wuhan 430060)

　　ABSTRACT　　Aim Cloning and expression the fatty acid-binding protein (FABP) gene of schistosoma japonicum to produce a candidate vaccine antigen for schitosomiasis.Methods the cDNA gene of S.japonicum was amplified by a pair of primers designed according to the FABP gene,and the PCR products was digested with restrition endonuclease BamHI and EcoRI respectively for a directional gene cloning to the expression vector PEGX2-T,then studying its expression in E.coli.Results The objective gene was successfully cloned and the sequence analysis of this gene revealed 99.3% identity with the reported sequence.It could be induced to express a 44kD fusion protein in E.coli and the recombinant antigen could be recognized differentially by the sera from chronic schitosomiasis patient.Conclution A schistosomiases condidate vaccine molecular has been expressed and it has laid the foundation of further research.

　　KEY WORDS　　Schistosoma japonicum　　Fatty acid-binding protein　　PCR　　Gene cloning　　Vaccine

　　脂肪酸结合蛋白 (FABP) 是血吸虫的一种生理性蛋白，利用之血吸虫可从宿主体内获得其自身不能合成的长链脂肪酸及固醇类物质，并合成拮抗宿主免疫攻击的脂肪簇衍生物，天然提取的血吸虫 FABP 能诱导小鼠产生免疫保护^［1，2］，因而被认为是有希望的疫苗候选成分。本研究利用重组 DNA 和 PCR 技术克隆日本血吸虫大陆株的 FABP 基因，并诱导表达该重组抗原以供进一步的疫苗研究

　　1　材料与方法

　　1.1　血吸虫　日本血吸虫成虫购于湖南省寄生虫病防治所，慢性血吸虫病人血清取自武汉市血防站。

　　1.2　质粒、酶及所用试剂　质粒 PEGX-2T、逆转录试剂盒及产物提纯试剂盒(Pharmacia),BamHI、EcoRI 内切酶及 T4DNA 连接酶 (Promega),PCR 试剂盒(华美生物技术公司产)。

　　1.3　PCR 扩增　参照Chomczynski^［3］的方法提取血吸虫 RNA ，逆转录为 cDNA 后作为 PCR 模板。根据已发表的血吸虫 FABP 序列^［4］设计引物，上游引入起始码 ATG 和 BamHI 内切酶位点，下游引入终子码 TGA 和 EcoRI 内切酶位点，其序列如下：

　　引物1　5′-TAGGATCCATGTCTTCGTTCTTGGGAAAG-3′

　　引物2　5′-GCCTTAAGTTGCAGCGGTTACAATCGTTT-3′

　　按常规方法 PCR 扩增，2.0%琼脂糖电泳鉴定。

　　1.4　克隆、鉴定及序列分析　PCR 产物及载体分别经 EcoRI 和 BamHI 酶切，连接后转化于大肠杆菌 DH5α 株，涂布氨苄青霉素抗性 LB 平板，用 PCR 方法鉴定重组情况。按双脱氧 DNA 测序法^［4］，用提纯的重组质粒双链 DNA 为模板，与荧光物质 Cy5 标记的引物反应，ALFexpress 全自动测序仪进行荧光测序。

　　1.5　重组 FABP 表达、纯化及鉴定　将 FABP 基因定向重组到原核表达质粒 PEGX—2T 的谷胱甘肽转移酶 (GST) 基因下游，IPTG 诱导表达 GST 融合蛋白。收集表达菌，0.01mol 磷酸盐缓冲液悬浮，超声裂解，4℃10 000 r/min 离心10min 取上清，用谷胱甘肽偶联胶对裂解液中 GST 融合蛋白进行亲和纯化，方法参见该试剂盒的说明书。SDS—PAGE 鉴定重组蛋白的分子量。

　　抗原性鉴定：采用 Dot-ELISA 法，分别以倍比稀释的重组 FABP 抗原、血吸虫成虫抗原以及无关抗原(重组乙肝核心抗原)进行硝酸纤维素膜点样，依次与血吸虫病人血清及酶标羊抗人 Ig 反应，DAB 显色。

　　2　结　果

　　2.1　血吸虫 FABP 的基因克隆　用我们设计并合成的 PCR 引物扩增日本血吸虫大陆株的 cDNA 模板后获得约 420bp 的扩增片段(图1)，酶切后分别克隆到质粒 PUC18 和PEGX—2T，前者用于序列分析，后者用于表达研究。重组质粒经 PCR 检测和酶切分析均证实含有相应大小的外源基因片段。

图1　FABP 基因 PCR 扩增产物的鉴定

　　1.DNA 分子量标准

　　2.阴性对照

　　3～4.FABP 基因 PCR 产物

　　Fig.1　Identification of FABP gene PCR products

　　1.φ_χ174 DNA/Hae Ⅲ markers

　　2.Negative control

　　3～4.FABP PCR products

　　2.2　DNA 序列分析　测序工作在北京 Parmacia 生物技术中心完成。结果表明：血吸虫 FABP 的编码基因全长为399bp,共编码132个氨基酸，推测其蛋白分子量为14.7kD,同文献^［4］报道的一致，序列同源性为99.3%(图2)。

图2　　日本血吸虫大陆株 FABP 基因序列

　　Fig.2　The sequence of FABP gene from schistosoma japonicum(Chinese mainland origin)

　　2.3　重组 FABP 的表达与鉴定　重组 PEGX—2T 质粒能在大肠杆菌 DH5α中高效表达，纯化的表达产物在44kD 处呈现清晰的蛋白带(图3)，其分子量相当于 GST(29kD) 与 FABP 之和，同预期结果一致。用 Dot-ELISA 法进行血清学检测表明，血吸虫成虫抗原和重组 FABP 抗原能被慢性血吸虫病人血清特异性识别(图4)。

图3　SDS-PAGE 分析日本血吸虫 FABP 基因的表达及产物纯化

　　1.蛋白质分子量标准

　　2.载体 PEGX2-T 在 DH5α中表达(纯化)

　　3～6.重组质粒 PEGX2-T/FABP 在 DH5 中表达(纯化)

　　7.载体 PEGX2-T 在 DH5α中表达(未纯化)

　　8～11.重组质粒 PEGX2-T/FABP 在 DH5α中表达(未纯化)

　　Fig.3　SDS-PAGE analysis of FABP gene from S.japonicum expression and product’s purification

　　1.standard molecular weight marker protein

　　2.PEGX2-T in DH5α(purified)

　　3～6.PEGX2-T/FABP in DH5α(purified)

　　7.PEGX2-T in DH5α(crude)

　　8～11.PEGX2-T/FABP in DH5α(crude)

图4　表达产物与血吸病人血清的 Dot-ELISA 反应

　　1.血吸虫成虫抗原

　　2.阴性对照

　　3～4.重组的血吸虫 FABP

　　Fig.4　Reaction of the expressed products with serum from Schistosomiasis patient

　　1.Native protein from Schistosoma japonicum

　　2.Negative control

　　3～4.Recombinant FABP of S.japonicum

　　3　讨　论

　　血吸虫的抗原成分较复杂，其诱导机体产生免疫保护的机制亦不尽相同，对不同类型的抗原进行优化组合可望制备出有效的血吸虫基因疫苗^［6］。本研究对血吸虫 FABP 基因进了克隆和表达，便于进一步探讨其对机体诱导的免疫保护力和保护机制。

　　在基因克隆时，采用 PCR 方法筛选重组质粒一方面能简化克隆程序，即在进行目的基因与载体间连接之前可省去将酶切产物进行电泳分离和回收的步骤而直接进行连接；另一方面在对重组质粒进行酶切分析时发现 PCR 法筛选的克隆较可靠，而当外源基因较小时，根据质粒的迁移率难以准确判断重组情况。

　　原核系统中表达融合蛋白的优点在于表达效率高以及容易纯化，其缺点是易失去天然蛋白的活性。但血清学分析结果表明，在大肠杆菌中表达的 FABP 仍能保持良好的抗原性。

　　4　参考文献

　　1.Furlong ST,Caulfield JP.Schistosoma mansoni:Synthesis and resease of phospholipids,lysophopholipids and neutral lipids by schistosomula.Exp Parasitol,1989,69:65.

　　2.Rodnguez-Perez J,Medina JR,Blanco MA,et al.Fasciola hepatica molecular cloning,nucleotide sequence and expression of a gene encoding a polypeptide homologous to a Schistosoma mansoni fatty acid-binding protein.Exp Parasitol,1992,74:400.

　　3.Chmczynski P，Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phneol-chloroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156.

　　4.Becker MM,Kalinna BH,Waine GJ,et al.Gene cloning,overproduction and purification of a functionally active cytoplasmic fatty-binding protein(Sj-FABP_C)from the human blood fluke Schistosoma japonicum.Gene,1994,148:321.

　　5.Sanger F,Nick S,Coulson AR.DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.Proc Natl Acad Sci USA,1977,74:5463.

　　6.Bashir M,Bushara H.Evaluatin of defined antigen vaccines against Schistosoma bovis and S.japonicum in bovines.Trop Geogr Med,1994,46:255.

1998年6月27日收稿　1998年11月15日修回