抗血吸虫生殖免疫的研究进展

疾病控制杂志 1999年第2期第3卷 讲座与综述

作者：郑亦男　吴忠道　余新炳

单位：中山医科大学寄生虫学教研室，广东 广州　510089

　　关键词： 血吸虫；抗生殖免疫；抗原

　　【指示性摘要】　血吸虫抗生殖免疫是当今控制血吸虫病的一个新的研究热点。本文就减毒尾蚴、未成熟虫卵可溶性抗原、谷胱苷肽-S-转移酶(GST)、卵壳蛋白、31/32 KDa抗原、铁蛋白、原肌球蛋白、副肌球蛋白等具有抗生殖免疫效应的抗原、其基因序列及氨基酸序列分析等作一综述。

　　【中图分类号】 R383.24　　　【文献标识码】 A　　　【文章编号】 1008-6013(1999)02-0126-04

Latest development in research on anti-fecundity immunity

ZHENG Yi-nan, WU Zhong-dao, YU Xin-bing.

Department of Parasitology, SUN YAT-SEN University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China

　　【Indicative Abstract】　Anti-fecundity immunity is a lately developed focus of schistosomiasis controlling. This review concerns antigens and sequence analyses, such as SIEA，GST, glutathione S-Transferase 28-Kds or 26-Kda, antigen 31/32 KDa and fropomyosin having anti-fecundity effects.

　　【Key words】　schistosome; anti-fecundity immunity; antigen

　　目前控制血吸虫病的一个引人瞩目的研究热点是抗血吸虫疫苗的研制^［1］，其目标是消除血吸虫感染引起的严重病理改变和阻断传播。由于成熟虫卵是引起血吸虫病的主要因素和传播血吸虫病的唯一因子，因此，发展抗血吸虫生殖疫苗对于血吸虫病的预防和控制具有重要意义。

　　1　血吸虫的生殖过程及其影响因素

　　所谓抗血吸虫生殖免疫，就是通过主动免疫或被动免疫的方法诱导宿主产生抑制雌虫产卵和/或卵胚发育的保护性免疫^［2］。

　　影响血吸虫两性虫体发育成熟的主要因素：(1)两性虫体的合抱。合抱的雌雄虫之间存在营养和信息的联系，因此，单性雌虫不能发育至成熟，而单性雄虫虽可发育成熟，但时间长，体形小；(2)机体免疫产生的多种细胞因子的作用。多种抗原分子诱导的抗生殖免疫主要表现在两个方面：其一，抑制雌虫产卵，机体免疫产生的多种效应因子可抑制雌雄虫合抱，雌虫发育不能成熟，导致产卵能力丧失^［3］。支持这种假设的有：在苏丹，有感染的牛免疫后虽有大量成虫寄生，但并不排卵，而把成虫转移至非免疫的牛体内，产卵能力则恢复^［4］。其二，阻碍虫卵发育，抗虫卵免疫，大部分学者认为其免疫机理主要是卵内环卵沉淀物的形成可使卵壳微孔变大，免疫球蛋白可通过扩大的卵壳微孔进入虫卵，杀死卵胚^［5］。Hirata等^［6］人认为这种免疫球蛋白主要是IgG类；同时，抗原抗体复合物堵塞卵壳微孔，阻止虫卵抗原逸出，通过卵内代谢物的储积来杀死卵胚或毛蚴。也有人认为抗卵免疫这一过程有特异性抗体直接杀伤毛蚴和细胞免疫机制的参与；(3)雌虫产卵能力还受到生存环境虫体密度的影响，组织虫卵数和粪卵数的统计分析表明严重感染动物体内成虫生殖能力下降。

　　2　抗生殖免疫的抗原及相关基因

　　近几年，国内外学者针对血吸虫抗生殖免疫做了一些探索性的工作，1983年，Garcia等首先用血吸虫未成熟虫卵免疫小鼠，诱导小鼠产生了一定的抗生殖免疫作用。此后，有学者先后用照射尾蚴、未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)、多种分子抗原进行实验，皆获得一定的抗生殖免疫效果。目前，已证实可产生抗生殖免疫作用的抗原有以下几类：

　　2.1　照射减毒尾蚴　利用减毒尾蚴免疫实验动物预防血吸虫感染已成为一种成功的方法。减毒尾蚴诱导的特异性免疫在鼠类已被证实^［7］。此外，不同的实验室还用X线、⁶⁰钴、紫外线、γ-射线照射日本血吸虫及曼氏血吸虫尾蚴，免疫水牛、猪、食蟹猴等实验动物，均获得保护性免疫。最近，日本一实验室用紫外线减毒尾蚴免疫小鼠，再用尾蚴攻击感染，发现与对照组相比，第6～7周，总虫卵数明显下降，肝和小肠中每条雌虫产卵数降低55%～82%；第8周，免疫鼠产卵数降低不明显。为探讨其免疫机制，作者用特异性抗SmGST血清及脾脏T淋巴细胞进行了被动转移试验，结果前者成虫产卵量无改变，而后者明显下降。由此推论，是局域细胞产生的淋巴因子削弱成虫最佳的产卵状态，而此种因子在血清中水平不高。8周后免疫效应消失，认为是抗卵免疫应答下调减毒尾蚴免疫产生的细胞因子所致^［8］。但因抗原受大批量供应困难以及潜在致病危险等因素的限制，故现在减毒尾蚴抗原主要应用于诱导机体产生保护性抗体来筛选有效的疫苗侯选分子，为重组DNA疫苗研究提供实验方法。

　　2.2　未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)　汪世平等人用血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)及成熟虫卵可溶性抗原(SEA)分别免疫Balb/c小鼠，发现SIEA诱导小鼠产生显著抗生殖和抗卵胚发育免疫力^［9］。与对照组比较，SIEA免疫鼠在感染后46天，肝、肠组织内每条雌虫产卵数分别下降36.43%和28.0%，尤其肝、肠组织内成熟虫卵数和粪卵数下降显著，分别达59.98%、66.86%、66.97%。SEA免疫后未呈现上述结果。但SIEA中究竟是何种抗原分子起作用，尚未见报道。为此，作者采用SDS-PAGE和ELIB技术对SEA和SIEA进行比较分析，结果二者主要蛋白区带存在显著差异，同时ELIB结果表明SIEA中感染血清免疫识别的67 KDa、62 KDa、54 KDa、50 KDa、28 KDa、26 KDa等抗原组分不出现SEA。推测这些分子在SIEA诱导产生雌虫抗生殖和抗卵胚发育应答方面起关键作用。

　　此外，作者还进一步应用日本血吸虫未成熟卵抗原超免疫血清对SjcDNA文库进行免疫筛选，共鉴定阳性克隆102个，进一步复筛后，对其中6个阳性克隆以自动DNA测序仪对插入子的cDNA测序，并进行了同源性分析，结果表明：Yc40克隆类似于Sm铁蛋白基因，WYC8类似于N.frontails的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因，Yc15为Sj热休克蛋白70基因，Yc29为副肌球蛋白基因，Yc30和Yc17克隆分别为卵壳蛋白基因和钙网硬蛋白基因，上述6个基因克隆的同源程度分别为74.0%，57.1%、80.0%、86.4%、96.4%和80.6%^［10］。

　　2.3　谷胱甘肽-S-转移酶(GST)　GST作为一系列异生物质的解毒酶广泛存在于生命体中，它能连接还原的谷胱甘肽到亲电子中心。免疫化学分析表明每种日本血吸虫(Sj)和曼氏血吸虫(Sm)至少有两种GST异构酶(Sj 26 KDa GST、Sm 26 KDa GST和Sj 28 KDa GST、Sm 28 KDa GST)，编码这四种GST的cDNA克隆已被分离。氨基酸测序表明26 KDa和28 KDa GST有严格区别。Sj 26 KDa和Sm 26 KDa与哺乳纲u-GST表现同源性，Sj 28 KDa和Sm 28 KDa与a-GST相似^［11］。

　　现有的研究表明28 KDa GST具有免疫保护特性和作为疫苗的潜力。最初，在一系列动物模型中用纯化抗原或重组蛋白Sm 28 KDa GST进行抗感染实验，均可诱导出高水平的保护作用—在大鼠中成虫负荷减少51%～72%，在小鼠减少40%～43%，田鼠减少52%^［12］，啮齿动物和水牛减少可达80%，平均38%^［13］。继而，Boulanger等用Sm 28 KDa GST进行主动免疫和mAb被动转移实验^［13］，结果显示其能减少雌虫生殖和虫卵孵化能力；Xu^［14］等分别用Sm 28 KDa GST免疫牛，均获得相似的抗雌虫生殖和抑制虫卵发育的实验结果。法国Capron实验室在此基础上对Sm 28 KDa GST活性表位及S13 mAb识别部位作了定位研究，表明Sm 28 KDa GST活性表位及mAb识别部位为羧基端(CT)10-36肽段，氨基端(NT)190-211肽段。进而，分别用羧基端(CT)10-36肽段、氨基端(NT)190-211肽段、两者组合体及Sm 28 KDa GST进行免疫后观察雌虫生殖和虫卵孵化能力，均可见明显抑制效应。由此推测，S13 mAb抗生殖免疫的机制是抗体结合到酶的活性部位及其邻近区域，抑制了Sm 28 KDa GST活性^［15］。在此基础上，许多专家设想通过重组115-131肽段(减少成虫负荷)、NT及CT端构建一种疫苗，使其产生与Sm 28 KDa GST相同的免疫活性^［15］。这种疫苗策略虽理论上具有很多优点，但尚需完善，必须进一步深入研究，准确定义功能性免疫反应特征，并掌握免疫诱导的条件。

　　Liu等^［16］在小鼠、猪、水牛等动物模型中重组reSjc 26 KDa GST及其抗体进行免疫实验，得到相似的抗生殖实验结果。例如，在水牛组，用reSjc 26 KDa GST免疫后，用Sjc 26 KDa GST具有良好的抗卵免疫活性，可减少免疫后动物的病理改变和血吸虫的传播。但有资料证实，用重组Sj 26 KDa GST免疫动物不足以诱导产生持久免疫^［17］，只可作为多组分疫苗的成分之一。

　　石佑恩等从日本血吸虫大陆株成虫分离总RNA，逆转录合成cDNA第一链，根据菲律宾株的cDNA序列合成引物，扩增26 KDa的编码区基因，将该片段克隆到Bluescript质粒酶切后，测序结果与菲律宾株比较核苷酸同源性99.8%，仅第582位碱基因不同，从cDNA推导出的氨基酸序列，两者100%相同；与曼氏血吸虫比较，核苷酸同源性81.3%，氨基酸同源性80.6%^［18］。

　　2.4　卵壳蛋白　成熟雌虫日产卵量大约1 000～3 500个，每个卵由一个受精卵细胞和18～24个卵黄细胞配备而成，其卵壳的前身物质是由卵黄腺合成的有关氨基酸提供，所以抑制卵黄蛋白的合成代谢可能是设计新型抗血吸虫疫苗的新构想。

　　随着分子生物学的发展，已发现编码卵黄蛋白主要成分-卵壳蛋白的雌虫特异性基因，又称卵壳蛋白基因。基中了解得最多的是曼氏血吸虫卵壳蛋白三种基因P48、P14和FS800、埃及血吸虫Sh.E2-1和Sh.E6-1基因及日本血吸虫ESG基因家族。

　　曼氏血吸虫P14有三个阅读框(ORF)，二个在编码链上，一个在互补链上，ORF1编码16 KDa多肽，该蛋白与silkmoths的卵壳蛋白有很高的同源性。抗ORF1翻译的可溶性蛋白多抗血清识别成熟雌虫卵细胞中的卵黄颗粒，western blot结果显示抗血清可识别14 KDa的虫卵蛋白组分。P48也有三个阅读框(ORF)，其中二个在编码链上，一个在互补链上。ORF1编码48 KDa卵壳蛋白，ORF2编码43 KDa多肽，ORF3编码44 KDa多肽。抗ORF1翻译的可溶性蛋白抗血清可识别一个50 KDa的成熟雌虫蛋白分子，但不能识别雄虫和未成熟雌虫蛋白分子。因此，P14和P48的ORF1编码具有抗原性的基因表达产物。埃及血吸虫也找到类似卵壳蛋白基因Sh.E2-1和Sh.E6-1。Sh.E2-1表达19 KDa的蛋白，Sh.E6-1表达17.65 KDa的蛋白。在Sh.E2-1编码区发现有附加的26个氨基酸，其中19个甘氨酸，2个谷氨酸，1个精氨酸，占总编码区5%，而在Sh.E6-1无类似发现。此外，发现5′和3′端DNA的同源性高达90%，编码区高达72%。两端侧区含有调节卵壳蛋白基因产物的核心序列TCACGT；日本血吸虫已建cDNA文库，也分离出卵壳蛋白基因家族成员ESG-1，ESG-2A，ESG-2B，ESG-3，其大小分别为2.5 Kb、1.9 Kb、1.9 Kb和1.0 Kb。ESG-1的表达产物ESP-1有212个氨基酸，分子量18.92 KDa，ESG-2A的表达产物ESP-2A含207氨基酸，分子量18.5 KDa。Bobek等采用杂交方法分离出日本血吸虫2.6，2.0和1.3 Kb三个独立的ESG克隆。刘兰英根据Henkle等报道的日本血吸虫(菲律宾株)卵壳蛋白的DNA序列设计了一对引物，采用PCR方法从日本血吸虫大陆株基因组DNA扩增出618 bp的基因片段，并定向克隆进真核表达质粒pcDNA3/sjESG，并转染Hala细胞进行真核表达。重组蛋白的分子量为22 KDa，Dot Blot和Western blot分析显示，卵壳蛋白能被感染血清、雌虫免疫血清、虫卵免疫血清特异性识别，并能特异性地刺激免疫小鼠脾细胞产生增殖反应。用重组质粒pcDNA3/sjESG直接接种Balb/c小鼠，可诱导小鼠产生一定程度的保护性免疫力，其减卵率为44.66%。初步研究结果提示，日本血吸虫卵壳蛋白基因编码的蛋白分子可诱导宿主产生干扰雌虫发育和虫卵形成的特异性免疫反应^{［19～21］}。

　　2.5　31/32 KDa抗原　陈焱等^［22］用超凝胶柱层析法分离纯化的日本血吸虫31/32 KDa抗原免疫小鼠诱导保护免疫力。结果表明，免疫组小鼠肝、肠组织中总虫卵数明显下降，粪卵数减少63.8%～78.3%，雌虫子宫内虫卵数降低53.2%，肝、肠组织中死卵数明显增加，这种保护性免疫力仅有抗卵效果，无抗成虫作用。说明31/32 KDa抗原可诱导小鼠产生抗卵免疫干扰虫卵形成，加速虫卵死亡，提示可能是一种有希望的抗血吸虫生殖免疫的侯选抗原。31/32 KDa抗原免疫导致雌虫子宫内虫卵生成减少，推测机理是成虫血红蛋白酶的活性被抑制，所吞噬的红细胞利用率降低，虫体不能为虫卵形成提供足够的原料所致。

　　2.6　铁蛋白及其调控基因　易新元实验室用日本血吸虫未成熟虫卵抗原超免疫兔血清(RASjIEA)对成虫cDNA文库进行筛选得到铁蛋白基因的阳性克隆，并亚克隆于pGMC载体，在IPTG诱导下重组蛋白以MCSF(粒细胞巨噬集落刺激因子)-Sj Fer(铁蛋白)融合蛋白的形式在细菌中高效表达。SDS-PAGE及免疫印迹表明表达产物为不溶性包涵体，仅溶于SM尿素溶液中，分子量为40 KD^［23］。

　　2.7　原肌球蛋白与副肌球蛋白　原肌球蛋白是一种重要结构蛋白。曹建平等人首先建立了抽提和纯化日本血吸虫和钉螺原肌球蛋白(分别称为SjcTM和ObTM)的方法，抽取的蛋白纯度均在90%以上，分子量分别为39 KD和40 KD，其耐热、酸性蛋白质、脯氨酸和色氨酸定性试验，以及羟基磷灰石和DEAE纤维素层析法脱曲线等均符合原肌球蛋白特性。用SjcTM(5 μg/鼠/次)或ObTM(3 μg/鼠/次)加福氏佐剂免疫小鼠共3次后，以日本血吸虫尾蚴攻击感染，6周后剖杀小鼠，结果表明，其具有明显抗生殖免疫效果，平均每对成虫肝脏减卵率分别为20.1%和52.2%(P＜0.01)，肠组织减卵率分别为32.8%和28.1%，肝脏成熟虫卵减少率分别为25.9%和46.8%(P＜0.01)，在肠组织的成熟虫卵减少分别为39.7%和66.8%，认为原肌球蛋白具有日本血吸虫病疫苗候选抗原分子的潜在价值。随后，用计算机设计一对分别有不同限制性酶切位点及起始和终止密码子的寡核苷酸引物，以日本血吸虫总cDNA为模板，对原肌球蛋白编码基因进行扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳观察约820 bp，PCR产物纯化后与pGEM-T载体连接直接克隆后测序。该核苷酸序列和推测的氨基酸序列分别与曼氏血吸虫原肌球蛋白有91.1%和98.1%的同源性。

　　副肌球蛋白抗原是当前血吸虫疫苗候选抗原之一。宋光承等人进行了天然虫源及螺源副肌球蛋白免疫小鼠保护性免疫效果观察表明，肝组织内虫卵减少率分别为59.2%(P＜0.01)和46.6%(P＞0.05)，肠组织内虫卵减少率分别为43.4%和37.3%(P＞0.05)；以上结果提示日本血吸虫副肌球蛋白可考虑为混合疫苗候选抗原之一。

　　抗血吸虫生殖免疫疫苗的发展虽然时间很短，但却经历了从大体抗原到分子抗原的逐渐优化、选择、发展的过程。多种分子抗原免疫作用的发现及对抗原基因的深入研究为血吸虫抗生殖重组疫苗的发展打下了坚实的基础，但仍需进一步探索以发现更多的组分抗原及相关的抗原基因，研究抗原诱导的免疫应答的发生机制和必须的免疫诱导条件，从而加速血吸虫生殖免疫疫苗的研制步伐。

　　作者简介：郑亦男，女，27岁，硕士

　　余新炳，男，47岁，博士，教授，博士生导师

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收稿日期　1999-02-28