5′端帽状结构对乙脑病毒RNA稳定性和感染性的作用

细胞与分子免疫学杂志 1999年第2期第15卷 研究简介

作者：黄庆生　姜绍谆　马文煜　张富泉　樊英茹　肖毅　刘利兵

单位：第四军医大学微生物学教研室，西安，710032

　　5′端帽状结构对多数病毒RNA的稳定性和感染性具有重要作用，而对另一些病毒的RNA则非必需^〔1～3〕。乙脑病毒基因组为单股正链RNA，长约11kb，5′端有帽状结构，3′端无PolyA^〔4，5〕。为了验证5′mGpppA对乙脑病毒RNA稳定性和感染性的作用，我们采用本室构建的乙脑病毒感染性克隆（乙脑病毒全长cDNA,克隆于T7启动子下游）体外转录出感染性RNA(即感染性转录体)，对在转录反应中掺入与不掺入5′mGpppA所获得的RNA,在转染BHK细胞后的病变效应及免疫荧光强弱是否相同，确定5′mGpppA对乙脑病毒RNA稳定性和感染性的作用。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　乙脑病毒全长cDNA克隆为本室构建。T7RNA聚合酶购自日本宝生物公司（Takara），5′mGpppA购自宝灵曼公司；rNTP购自Promega公司；RNasin和脂质体购自GIBCO/BRL公司。

　　1.2　方法^〔6，7〕　10μg含JEVcDNA的克隆载体，用ScaI在JEVcDNA末端切开，使呈线状。分A、B两组，每组均含下列成分：5μg线状DNA，10mmol/LrNTP各5μl，RNasin 20U，10×buffer 5μl T7 RNA 聚合酶35U，A组加100 mmol/L5′mGpppA2μl，B组不加5′mGpppA。两组各补加无RNA酶的去离子水至50μl，37℃3h。将两组转录产物分别加入150μl无血清的RPMI-1640中（含20μl的脂质体），轻轻混匀，转入35mm培养碟的BHK单层细胞中（细胞已用无血清的RPMI-1640洗两遍），补加300μl无血清RPMI-1640，37℃3h后弃去碟中液体，加入2ml含2％小牛血清的RPMI-1640，37℃培养，观察病变结果。同时设只加脂质体不加转录产物的阴性对照。将上述A、B两组细胞及阴性对照细胞，观察1周后固定，用抗乙脑病毒的mAb做免疫荧光染色，确定病变是否特异及比较荧光强弱。

　　2　结果和讨论

　　加5′mGpppA组与不加5′mGpppA组在第5天都开始出现病变，到第7天两组细胞的病变基本相同，大约达到“＋＋＋”（约70％～80％细胞产生病变），而阴性对照组细胞则无病变。mAb荧光染色结果表明，细胞病变为特异性的，A、B两组都出现较强的特异性荧光，阴性对照组无特异性荧光。

　　对RNA病毒而言，一般认为帽状结构可增加RNA的感染性，这可能与其可提高翻译效率、增加RNA的稳定性和防止宿主细胞对RNA的降解有关。但从本实验结果看，裸露的乙脑病毒RNA带不带有5′mGpppA对其感染性和稳定性看不出有何影响。而天然的乙脑病毒RNA都带有帽状结构，这一结构究竞对该病毒的转录与翻译起何作用？有待于进一步探讨。而阐明这些机理对RNA病毒的分子生物学研究则有重要的意义。

　　作者简介：黄庆生，男，35岁，博士生。西安市长乐西路17号,Tel.(029)3374526

　　参考文献

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　　［7］Sumyoshi H,Hoke CH,Trent DW，et al. Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro ligated cDNA templateds.J Virol,1992;66(9):5425～ 5431

收稿：1999－02－23

　　修回：1999－03－15