地鼠肾细胞狂犬病疫苗的纯化研究

中国人兽共患病杂志 1999年第2期第15卷 实验研究

作者：鲁　宏　窦志勇　钱　浩　李福安

单位：辽宁省卫生防疫站(沈阳110005)

　　关键词： 地鼠肾细胞狂犬病疫苗；凝胶过滤柱层板；离子交换柱层析

　　摘要　我们应用凝胶过滤及离子交换柱层板法对地鼠肾细胞狂犬病疫苗进行纯化，结果表明，凝胶柱层析法即可使该疫苗效价达到4.8IU/ml，小牛血清残留置小于50ng/ml，符合《中国生物制品规程》要求。并经离子交换柱层板后，效力降低至1.9IU/ml，病毒损失较大。故只采用凝胶过滤柱层析法做为该苗的纯化工艺，并为大规模生产提供依据。

ON THE STUDY PURIFICATION OF THE rABIES VACCINE

　　dEVELOPED FROM HAMSTER KIDNEY CELLS

Lu Hong　Dou Zhiyong　Qian hao　Li Fuan(Liaoning Public Health & Anti-epidemic Station,Shenyang 110005)

　　ABSTRACT in this paper,gel filtration chromatography (GFC) and ionexchange chromatography(IEC) were used to purify the rabies vaccine developed from Hamster kidney cells.The results indicated that to titer could reach to 4.8 IU/ml with GFC method a higher virus titer,in addition,fetal calf serum residue was less than50ng/ml,which is in conformity with the requests of “ the Procedures of China biological Products ”.However,using IEC method again after GFC resulted in a great deal of decrease of vaccine virus titer,which was 1.9IU/ml.The lost amount of the rabies viruses was great.Therefore,only the GFC used in the paper to purify the rabies vaccine developed from Hamster kidney cells is an effective,and with wiich a practicable method.Furthermore,this paper also provides a technique basis for the manufacture of vaccines on a large scale.

　　KEYWORDS Rabies vaccine developed from Hamster kidney cells Gelfiltration chromatography (GFC)Ionexchange chromatography (IEC)

　　狂犬病是一种人畜共患的病毒性传染病，人一旦被病畜咬伤发病，病死率为100%，及时注射疫苗及预防性接种是防治狂犬病的唯一有效手段。我国自八十年代初应用地鼠肾细胞狂犬病疫苗，取得了一定的防治效果；1994年卫生部指示改为生产浓缩疫苗，尽管其免疫效价有所提高，但接种者的副反应发生率亦明显上升，生产研制安全高效的疫苗已成当务之急。因此，我们对地鼠肾细胞狂犬病疫苗进行了柱层析法纯化研究，现总结出较满意结果。

　　1　材料与方法

　　1.1　细胞与病毒培养　使用11～13克健康金黄地鼠，无菌取肾，按常规方法制备单层细胞，用10L转瓶于37℃及33℃常规培养。于授种后第4、第7天两次收获病毒液。

　　1.2　毒种　使用北京aG株固定毒为生产毒种，来源于中国药品生物制品检定所。

　　1.3　检测指标与方法　病毒毒力滴定，蛋白含量测定及效力试验等检测均参照《中国生物制品规程》^［1］。小牛血清残留量测定试剂盒购于卫生部中国药品生物制品检定所，方法参照盒内使用说明进行。

　　1.4　病毒液的浓缩与纯化　收获的病毒液大于5.5logLD₅₀/ml，经过0.45um滤膜去液澄清，用30万MW的超滤膜进行超滤浓缩，浓缩后用1∶1000至1∶6000的β-丙内酯灭活^［2］，灭活后的浓缩液经过凝胶过滤柱层析及离子交换柱层析进行两步纯化试验。

　　2　结果与讨论

　　浓缩灭活后的地鼠肾细胞狂犬病疫苗培养液经过凝胶过滤柱层析，经紫外检测，分离液形成两个蛋白紫外吸收峰。经ELISA检测证实，第一个吸收峰为病毒峰，第二个吸收峰为其它杂质成份。

　　病毒培养液在浓缩、纯化过程中主要指标变化参见表1。

表1　病毒液浓缩纯化中的指标

　　从表1中数据可见，病毒培养液的滴度由浓缩前7.8logLD₅₀/ml上升到浓缩后的8.9logLD₅₀/ml；免疫效价从3.4到IU/ml上升到8.7IU/ml，即病毒含量及免疫原性都有了提高，但小牛血清残留量亦明显升高，而经第一步凝胶柱层析后则明显下降至50ng/ml之下，可以达到规程要求；而免疫效价为4.8IU/ml，亦符合规程要求。收集病毒峰的样品再经第二步离子交换柱层析，进一步去除杂质以达到更高纯度，但可见免疫效价亦明显降低至1.9IU/ml，不符合规程的要求。

　　从以上试验数据分析，利用浓缩，柱层析技术对地鼠肾细胞狂犬病毒培养液进行后期处理，第一步凝胶柱层析后，其各项指标均可达到生物制品规程的规定，即小牛血清残留量小于50ng/ml，免疫效价大于2.5IU/ml。因有效地去除细胞碎片、细胞器及杂蛋白等成份，达到了纯化地鼠肾细胞狂犬病疫苗的目的。综上所述，故我们认为只采用凝胶过滤柱层析就可以纯化疫苗，不宜再做对病毒颗粒损失较大的离子交换柱层析法的第二步纯化。本工艺为今后大规模地鼠肾细胞狂犬病疫苗的纯化提供了一种简便有效的方法。3　参考文献

　　1.中国生物制品规程，一部，1995版中国人口出版社，1996；121.

　　2.WHO TRS 840∶205～207，1994.