Vero细胞狂犬病疫苗的免疫原性研究

中国人兽共患病杂志 1999年第1期第15卷 论　著

作者：陶小润　苏军英　王显军　郑大明　冯开军　黄捷通

单位：山东省卫生防疫站（济南，250014）

关键词：狂犬病；纯化Vero疫苗；中和抗体测定

　　摘　要　目的　研究Vero细胞狂犬病疫苗的安全性和免疫原性。方法　对11例暴露狂犬病病人进行常规5针注射Vero细胞狂犬病疫苗（PVRV），在注射后的不同时间抽取静脉血，用小鼠中和试验（MNT）等方法检测病人体内的中和抗体水平。结果　显示3种不同的方法在第0、7天时的体内中和抗体均未达到保护水平（＜0.5IU/ml）；14天时病人的中和抗体全部阳转，GMT为7.32IU/ml；28天时中和抗体达到最高值，GMT为14.58IU/ml；90天和180天的GMT分别为8.43和3.38IU/ml，阳性率仍为100％，抗体仍保持在较高水平。整个观察过程中无1例发性过敏反应。结论　PVRV具有良好的安全性和免疫原性。

STUDIES ON IMMUNOGENICITY OF PVRV

Tao Xiaorun Su Junying Wang Xianjun Zheng Daming Feng Kaijun Huang Jietong

　　(Shandong Provincial Health and Anti-epidemic Station,Jinan,50014)

　　ABSTRACT Aim To study the safety and the immunogenicity of PVRV.Methods 11 patients post-exposure to rabies were immunized by routine 5-dose PVRV.On different days after immunization,blood samples were collected and detected by means of MNT,RFFIT and ELISA for the neutralizing antibodies.Results It showed that on day 0 and 7,the antibody by the three methods did not reach the protective level(0.5IU/ml);on day 14,all the patients became positive to the neutralizing antibody,GMT was 7.32IU/ml;on day 90 and 180 the GMT was 8.43IU/ml and 3.38IU/ml respectively,and none of the blood samples changed to be negative.No allergic reaction was noticed during the observation.Conclusion It suggested that PVRV has high safety and immunogenicity which was generally acknowledged.

　　KEY WORDS Rabies PVRV MNT Antibody level

　　　狂犬病是人类迄今尚未能征服的疾病之一，其病死率为100％。目前降低暴露病人发病率最关键有效的方法就是实施疫苗免疫。自80年代以来，我国一直生产、使用原代地鼠肾细胞狂犬疫苗（PHKCV），此疫苗免疫后副反应大，时有免疫失败的病例报道^〔1～3〕。WHO于1987年颁发Vero细胞生产人用纯化灭活疫苗规程，并推荐用Vero细胞大量生产狂犬疫苗^〔4〕。此苗免疫效果好、安全稳定，随着经济技术的发展，它将取代PHKCV^〔1，5〕。目前PVRV在我国尚处于研究阶段，不能生产，需要进口。本试验目的就是要系统了解PVRV的免疫原性、安全性及免疫持久性。结果报告如下。

　　1　材料与方法

　　1.1　对象选择和标本收集　收集门诊重度咬伤病例（WHOⅢ度），按5针常规免疫程序，在病人上臂三角肌区注射PVRV（法国巴斯德公司生产，批号：Lot Lo890,0.5ml/l针剂），在有效期内使用。分别于第0、7、14、28天注射疫苗前和90、180天时抽取病人静脉血，收集血清冷冻备用。同时观察病人的过敏反应。

　　1.2　试验方法

　　1.2.1　小鼠中和试验(MNT)　选用CVS株9代毒种。免前血清1∶5稀释，免后血清1∶20、1∶60、1∶180、1∶540稀释。标准品冻干“9602标”由武汉生物所基因室提供，6.7IU/支，冻干“90RS”由北京检定所提供26.31IU/支，标准品1∶5稀释，与等量病毒混合成1∶180、1∶240、1∶720、1∶2160后置37℃水浴箱中和1h。选用10～12g健康小鼠，每只脑腔接种0.03ml中和物，每稀释度接种4只，病毒滴定，将中和病毒依次稀释成1/10、1/100、1/1000注射小鼠，中和毒在32～316LD50时，试验成立。每天观察小鼠发病及死亡情况，3天前死亡为非特异性死亡。最后计算血清效价，以国际单位（IU/ml）表示^〔6〕。

　　1.2.2　快速荧光灶抑制试验（RFFIT）　制备和滴定攻击病毒（CVS株），将固定量的病毒与系列稀释待测血清一起温育，包括已知滴度的参考血清。然后加入敏感细胞悬液，经24h温育，细胞单层用丙酮固定，用荧光标记的NP抗体染色，以检测未被中和的病毒的存在（荧光灶）。

　　1.2.3　酶联免疫吸附试验（ELISA）　ELISA试剂盒由武汉生研所提供，批号19970424，效期内使用，包被抗原为CVS株，按说明书操作。

　　2　结　果

　　2.1　病人观察　共收集有效病例11例，整个试验观察过程中无1例发生过敏反应或死亡，共收集病人静脉血66份。

　　2.2　试验结果　用3种不同的方法测得病人免前0天中和抗体，水平均极低，几乎为0；免后7天病人只有1例中和抗体达到保护水平（WHO规定抗体最低保护水平为0.5IU/ml）；14天MNT和REFIT（由于试剂不足，部分样本的RFFIT最高滴度仅做到1.5IU/ml，未继续稀释）结果均达到保护水平，ELISA阳性率为81.8％；28天病人中和抗体均达到高值，GMT为14.58 IU/ml；90和180天病人的中和抗体阳性率仍为100％，并保持在较高水平（见表1及图1）。

　表1三种不同实验方法测定免疫后不同时间的病人血清保护性抗体水平

　　Table 1Protective level of Patients after immunization with three methods in different days

M:MNT R:RFFIT E:ELISA

图1　11例病人免后不同时间的中和抗体水平（GMT）

　　Fig.1 Neutralizing antibody level of 11 patients after immunization

　　3　讨论与分析

　　自1885年Passteur最早研制出狂犬病毒神经组织疫苗以来，狂犬疫苗在预防人、畜狂犬病中发挥了巨大的作用，同时其生产技术也得到了迅速的发展。PHKCV以其成本低、技术条件要求不高，免疫效果较好等特点，被我国广泛使用，取得了一定的效果，尤其是近两年改为浓缩疫苗以来，免疫效价明显提高，但同时也带来了许多严重问题，由于未经纯化，注射剂量仍为2ml,接种后副反应也明显增强^〔3〕。有人曾做观察，浓缩疫苗疼痛占1.5％，发热占1％，荨麻疹1％，全身症状6％^〔7〕。有报道总的副反应率可达30％。另外，PHKCV的稳定性、中和抗体产生的时间和滴度都不是太理想，即疫苗的效期短，其抗体产生晚，消失早，阳转率低。曾有报道：免后第15天阳转率为51.9％，180天的阴转率为30％^〔8〕；也有人报道，1.3IU疫苗的阳转率为50％～60％，2.5IU疫苗的阳转率为88％～97％^〔2〕。并时有全程免疫失败的病例报告^〔2，7〕。基于以上原因，加速开发研制一种更加有效，纯度更高，安全、稳定的狂犬疫苗已成为当务之急，有关专家提出选择使用疫苗的标准应是：用量小，反应轻，接种次数少、接种后能快速（一般7～10天）产生中和抗体（有效的中和抗体水平应为＞0.51IU/ml，而不是用ELISA方法测出的抗体），并持续时间较长^〔3〕。WHO推荐用Vero细胞大量生产狂犬疫苗，它是用适应WI-38细胞的狂犬病固定毒PM株感染在载体上培养的Vero细胞、丙内酯灭活，进一步纯化制备而成，它比原代细胞制备上更有利于发展微载体大罐培养，更适宜大规模的批量生产。PVRV具有良好的耐受性、很强的免疫原性及安全性，其效期长，过敏反应极少，中和抗体在14天（接种过3针）时全部达0.51IU以上^〔5，9〕。这些报道和我们的试验结果一致。从本试验结果中可见，免前中和抗体均极低，说明病人在此之前均未接种过狂犬疫苗，14天病人血清中和抗体均达到保护水平，90天和180天病人的中和抗体阳性率仍为100％。由于免疫反应的个体差异，同一时间每个病人所产生的中和抗体水平差异很大。

　　目前国内对PVRV的免疫效果、安全性等进行全面系统研究的报道还很少，大多数是通过ELISA法对其和PHKCV的抗体水平做比较，一般得出的结论是两者效果无明显差异，有的甚至是PHKCV明显优于PVRV，作者认为仅仅通过ELISA测定抗体就做出这样的结论是不够妥当的，因为ELISA等方法所测得的抗体不是保护性的中和抗体，而是伴随抗体，其结果受很多因素的影响，尤其是不同的病毒株包被抗原，我们曾做过试验，用CVS株（国际标准攻毒株）和aG株（国内疫苗株）分别进行包被，对免疫不同的疫苗所检测的ELISA结果差异非常显著。目前WHO推荐用经典的MNT和RFFIT结果来评价狂犬疫苗的保护效果。国内专家也曾提出“有效的中和抗体，而不是用ELISA方法测出的抗体”，所不同的是MNT是动物体内中和试验，而RFFIT则是体外中和试验。

　　PVRV在我国正处于研究阶段，不能批量生产，尚需进口，加上各种税费，其价格昂贵。可喜的是，我国有关部门及专家已把浓缩纯化Vero细胞疫苗的研制列入95攻关和卫生部重点课题中^〔3〕。我们本次试验的目的，就是在于系统了解暴露狂犬病后，接种PVRV的免疫原性、安全性及免疫持久性，为PVRV在我国进一步研制、使用提供科学依据。但由于经费不足等原因，试验中检测样本的数量偏少，尚需进一步深入研究。

　　4　参考文献

　　1.朱家鸿.狂犬病毒疫苗的现状与发展.全国狂犬病监测与控制研讨会资料，烟台：1997.

　　2.陈阳，等.提高狂犬病疫苗免疫效果的关键.中国人兽共患病杂志，1995，11（3）：56.

　　3.俞永新.人和动物狂犬病防制研究进展.全国狂犬病监测与控制研讨会资料，1997.

　　4.高鸿瑞，等.狂犬病病毒Vero细胞适应株的建立及其应用于疫苗生产的可行性探讨.微生物学免疫学进展，1995，23（3）：129.

　　5.俞永新.第七届美洲狂犬病控制和研究进展国际会议简介.中国生物制品学杂志，1997，10（2）：65.

　　6.卫生部生物制品标准化委员会.中国生物制品规程.1995，201.

　　7.李军，等.人用浓缩狂犬病疫苗人体反应观察.中国人兽共患病杂志，1997，13（4）：67.

　　8.陈爱贞，等.不同剂量免疫后血清学效果观察.中华流行病学杂志，1996，17（3）139.

　　9.Nicholson KG,et al.Laboratory techniques in rabies.WHO,Geneva,1996,271.

1998年2月28日收稿　1998年8月13日修回