狂犬病毒分子生物学及遗传变异性研究进展

中国人兽共患病杂志 1999年第2期第15卷 综　述

作者：唐青　杨为松

单位：唐　青　北京中国预防医学科学院流研所(北京　102206)；杨为松　第四军医大学成都医院传染科

　　狂犬病毒属于弹状病毒科（Rhabddoviridae）狂犬病毒属（Lyssa virus），是可以引起人和多种动物致死性中枢神经系统感染，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁等临床表现为特征的病原体。许多动物既是储存宿主又作为传播媒介在世界范围内维系并传播着本病，家犬是狂犬病毒进入人群的主要传播媒介。根据血清学和抗原关系可以将狂犬病毒分为四个血清型：

　　血清Ⅰ型：包括古典狂犬病毒、街毒和疫苗株。

　　血清Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型为狂犬相关病毒，其原型株分别为Lagos bat、Mokola和Duvenhage病毒。

　　血清Ⅰ型的疫苗株对狂犬相关病毒很少或没有保护作用。遗传学研究肯定并扩展了这种分类：4种基因分型与4种血清分型相对应；此外后来从欧洲蝙蝠分离得到的狂犬病毒（European Bat Lyssaviruses，EBL1和EBL2）分为基因5型和基因6型。

　　1　狂犬病毒分子生物学特征

　　1．1　狂犬病毒基因组结构　狂犬病毒基因组由11928—11932个核苷酸组成，为单链、不分节段的负链RNA，含5个大的开放阅读框编码5种结构蛋白。基因组从3＇端至5＇端的排列顺序为N、M1、M2、G和L基因，分别编码病毒核蛋白（NP）、衣壳基质蛋白（M₁P）、膜基质蛋白（M₂P）、糖蛋白（GP）和转录酶大蛋白（LP）。每个基因由3＇和5＇端非编码区以及中间的编码区构成。狂犬病毒与其它弹状病毒最明显的不同在于在N基因的3＇端有一段58核苷酸的不翻译先导序列以及在每个结构基因之间的大小和序列不同的不转录的间隔区^〔1〕。

　　N基因片段有1424个核苷酸，编码病毒NP，N基因高度保守又高效表达，因此可以广泛用于狂犬病毒感染的诊断和调查。M1基因片段全长911个核苷酸，编码病毒M₁P。M2基因片段共有805个核苷酸，编码病毒M₂P。G基因片段由1675个核苷酸组成，从起始密码子ATG到终止密码子TGA共524个氨基酸，编码病毒GP。L基因片段是狂犬病毒基因组中最大的一个片段，全长为6475个核苷酸，编码LP。

　　1．2　狂犬病毒毒粒及其多肽研究　完整的狂犬病毒粒子由核衣壳和包膜两部分构成，核衣壳由毒粒RNA与三种蛋白结合组成，既NP、LP和M₁P；病毒包膜由GP和M₂P构成。

　　NP全长450个氨基酸，占狂犬病毒蛋白总量的36％，分子量约50．5kD，C端Ser389为磷酸化位点^〔2〕。NP在狂犬病毒复制过程中与基因RNA紧密结合成核糖核蛋白（RNP），保护核酸免遭核酸酶的破坏。在弹状病毒中，NP还与转录和复制的调节有关。在成熟病毒粒子中NP是构成核衣壳螺旋对称结构的主要成分。用单克隆抗体分析NP有3个空间位置明显区别的抗原位点，即：NⅠ、NⅡ和NⅢ，NⅠ和NⅢ分别与374—383和313—337位氨基酸的伸展有关。在NP多肽上还发现一些Th细胞表位，其中404—418位对鼠有保护作用。

　　LP是狂犬病毒最大的结构蛋白，长度为2142个氨基酸，在狂犬病毒基因转录与复制过程中发挥着关键的催化作用。由于其在病毒粒子和感染细胞中仅有少量，因此是在生化和免疫水平上研究最少的狂犬病毒蛋白。

　　M₁P是一个高度亲水性蛋白，长度为297或303个氨基酸，其结构的一个重要特点是磷酸化，所以也称其为磷蛋白。磷酸化使其整体上带负电荷，并且负电荷随着高浓度酸性氨基酸（天门冬氨酸和谷氨酸）而增加。M₁P与LP相互作用构成了完整的转录酶活性。150个LP分子、约950个M₁分子与RNP共同组成30—35圈螺旋状结构的毒粒核心部分——核衣壳，核衣壳具有全部转录与复制活性，可以独立完成基因组RNA的转录和复制，因此核衣壳具有感染性。

　　GP是一种跨膜糖蛋白，构成病毒表面突起（spikes），是狂犬病毒与细胞受体结合的结构，在狂犬病毒致病和免疫中起着关键作用^〔3〕。GP全长524个氨基酸，N端19个残基构成疏水性信号肽起始新生蛋白穿过粗而内质网膜。成熟肽从第20个氨基酸Lys开始^〔4〕，共含505个残基，分为膜外区：1—439位氨基酸；跨膜区：440—461位氨基酸和膜内区：462—505位氨基酸。不同的毒株其糖基化位点的数目和位置不完全相同，但319位糖基化位点存在于到目前为止测序的所有狂犬病毒中^〔5〕，其它位点在不同株之间表现不同。

　　M₂P是狂犬病毒最小的结构蛋白，肽链长202个残基，是一种连接蛋白，在核衣壳和病毒膜之间起着媒介作用。由于在1和72残基之间有一个主要抗原决定簇，该部位似乎与宿主对狂犬病的免疫反应有关。中心19个氨基酸片段（89—107位）表现出明显疏水性以锚定蛋白进入病毒膜中。最近对VSV的研究提议M2蛋白从病毒膜内侧伸展到核衣壳螺旋的内核^〔6〕，无论M2准确位置是哪，它在病毒形态形成中都起着重要作用。

　　2　狂犬病毒糖蛋白和核蛋白研究

　　过去用常规免疫学检验认为狂犬病毒所有毒株的抗原性相似，直到1978年Wictor等人^〔7〕首次用单克隆抗体通过病毒中和实验证实了不同狂犬病毒之间存在着抗原结构上的差异。此后又进行了一系列用单克隆抗体分析狂犬病毒抗原结构的研究，研究显示分离自不同动物宿主或不同地理位置的狂犬病毒存在着相当大的抗原差异，这种差异既存在于糖蛋白中也存在于核蛋白中^〔8〕。迄今国外已先后获得了一批抗不同型别狂犬病毒的糖蛋白和核蛋白的单抗，建立了单抗反应谱系用于狂犬及狂犬相关病毒的分类和抗原变异性研究^〔9〕

　　^〔3〕糖蛋白（GP）研究　GP无论从结构上或免疫水平上都是狂犬病毒蛋白中研究最多的一个，它既是有效的保护性抗原能诱导产生中和抗体和刺激细胞免疫，又是狂犬病毒与细胞受体结合的结构，并与毒力有关。首先，它起始了病毒与细胞特异性受体的结合，因此它在病毒的组织嗜性上起决定性作用^〔10〕；其次，与受体细胞结合后，GP作为媒介引起病毒膜与细胞内囊膜事合使病毒经过细胞内通道进入细胞^〔11〕，刺激宿主免疫系统引起中和抗体的合成^〔12〕。测定特异性抗GP单克隆抗体对病毒的交叉中和能力表明不同毒株之间存在着差异，这种差异与病毒分离的地区和宿主来源密切相联^〔13，7〕。

　　2．1．1　GP与保护性免疫的关系　GP是唯一产生狂犬病毒中和抗体的抗原，这种特性主要依赖于其三维结构的保持。狂犬病毒感染细胞培养液中还存在着一种可溶性GP（Gs），比较两者结构，Gs在C末端缺失28个氨基酸残基，破坏了跨膜区，使其不能结合在病毒包膜上，但抗原性却与GP相同，同样能诱导产生中和抗体^〔14〕。用单抗分析表明GP所有的抗原决定簇也存在于Gs。但Gs却不具备GP的抗感保护能力，提示GP羧基末端是其完整保护作用所必需的。目前已证实Gs只在319位有一个Asn（天冬氨酸）糖基化位点，GP则有两或三至四个糖基化位点，适当的糖基化对于GP的表达是重要的。

　　进一步比较Gs蛋白7个溴化氰水解片段（Cr）的免疫原性^〔15〕，发现只有Crl（1～14位氨基酸片段），Cr3（292～323位氨基酸片段）和Cr4（103～178位氨基酸片段）能诱导产生有意义的病毒中和抗体，此证明GP的免疫原性是存在于整个肽链中的某些特定区域。

　　已经证实狂犬病毒GP上至少存在3个中和抗体结合位点：GⅠ、GⅡ和GⅢ^〔16〕，其中GⅢ代表了GP最主要的抗原区，大致位于第300—357位区段；其次是GⅡ，大约位于34—200区段，GⅡ至少含两个主要表位：34—32和198—200区段。GP抗原性变化经常是因为GⅡ位点上34—42位、147位、184位和198—200位氨基酸及GⅢ位点上330—340位氨基酸的改变造成。

　　2．1．2　GP与宿主细胞的相互作用　狂犬病毒感染的重要特点是经肌神经感染而非血液传播，这种特点可能与病毒表面的特殊结构和体内神经细胞上特异性受体相互作用有关，而狂犬病毒吸附受体的物质结构基础便是GP。抗狂犬病毒GP特异性抗体，能有效抑制病毒在脑组织内，体外培养的细胞间进行扩散^〔17〕。目前认为狂犬病毒在机体内的细胞受体是乙酰胆碱受体（AchR）。动物实验显示不同动物对狂犬病毒的易感性同动物肌肉组织中AchR的含量呈高度正相^关〔18〕。进一步研究发现^〔19〕狂犬病毒GP与AchR的一种高亲和配体：箭毒样蛇神经毒素有明显的结构相似性，GP189—214区段的氨基酸序列与后者同AchR受体结合部位的氨基酸序列高度同源，其中Arg37是所有神经毒素中相应位置上绝对保守的唯一阳离子基团，可与AchR上的季铵基相互作用。另外，Asp31、Phe33、Gly38、Lys39也是与AchR结合的重要位点，在这些位点狂犬病毒GP和神经毒素的残基也相同。虽然狂犬病毒在体内是严格嗜神经性的，但在体外也能感染非神经组织细胞，并且繁殖良好^〔20〕。Supperti等^〔21〕发现细胞膜上的某些脂和糖类也与狂犬病毒的吸附有关。体外抗烟碱药物处理小鼠背根神经节细胞可以部分抑制狂犬病毒对神经节细胞的感染^〔22〕，因此也有人认为烟碱型受体也有可能与狂犬病毒入侵有关。

　　2．1．3　GP与致病性的关系　减毒和高神经毒狂犬病毒其细胞嗜性有所不同^〔23〕，高神经毒病毒株如CVS高度嗜神经，而ERA减毒株也感染非神经细胞。已经证实神经瘤细胞表面存在着特异性狂犬病毒GP附着点^〔24〕，若GP330位的Lysine和333位的Arginine被取代则会明显降低GP和神经瘤细胞之间的相互作用，体外试验也证实了这一点^〔25〕。比较一些抗原变异株发现在GP最主要的抗原区GⅢ一些特殊位点（如第330，333，338等）上发生氨基酸替换。用抗GⅢ的单克隆抗体筛选出来的10株抗原变异株中有9株表现出毒力减弱或无致病性^〔26〕，这些毒力变异株均有GⅢ区333位氨基酸的改变。Prehauld等注意到减毒株SADB19的GP序列与ERA株仅差3个残基，即56、242和256位的Val、Ser、Lys分别被Met、Ala和Glu所替换^〔27〕。其中后两个可能是糖基化位点，因此这种变异很可能导致GP构象的改变，说明除Arg333之外，GP还有其他与毒力相关的重要结构。此外GP本身还具有独立的细胞毒活性^〔28〕。

　　2．2　核蛋白（NP）研究　NP因其更为稳定且高效表达，所以更多的应用于狂犬病的诊断、分类和流行病学调查研究中。但随着研究的深入，NP在狂犬病免疫中的作用也越来越多地被人们所认识。

　　2．2．1　NP与保护性免疫的关系　新近的研究表明，除GP外，狂犬病毒内部的核糖核蛋白（RNP）在诱生保护性免疫方面也起着重要的作用。RNP是能诱生在不同型狂犬病毒之间起交叉反应的T辅助（Th）细胞抗原。狂犬病毒RNP诱生抗狂犬病毒保护力是由各种细胞因子，如：抗体、单核因子和淋巴细胞等参与的复杂的相互作用产生的。狂犬疫苗接种后人外周血分离到的狂犬特异性的反应T细胞要比其它疫苗接种后分离到的特异性T细胞数量多，在这些特异性反应T细胞中，多数表现T4抗原是Th细胞，它们绝大多数表现对NP特异性反应，提示NP是诱导狂犬病细胞免疫的主要成分。1989年Ertl等采用一套序列互相重叠的合成肽作了Th细胞反应性位点和主要组织相容性复合物限制性研究，发现NP394—408区段、404—418区段和21—35区段是Th细胞的主要表位，即可以在体内诱导产生特异性Th细胞，也表现相应的体外免疫反应性^〔29〕。

　　此外，NP对中和抗体产生具有促进作用，把NP加福氏完全佐剂初免小鼠后，用灭活狂犬病毒加强，中和抗体水平明显上升，而用GP加强，中和抗体产生不明显。NP抗体还能抑制狂犬病毒在细胞间的传播和在细胞内的繁殖^〔30〕。

　　2．2．2　NP在狂犬病毒分类研究中的作用 最初用高效价免疫血清发现的狂犬病相关病毒之间的差异通过抗狂犬病毒核衣壳蛋白单抗分析得到了证实，在抗核蛋白单抗反应基础上发展并建立起来的狂犬病毒抗原分型方法目前已被广泛应用^〔31〕。Kimura等比较了9株6个血清型的狂犬病毒NP氨基酸和核苷酸序列，发现在这9株病毒中Mokola病毒与其它病毒之间差异最大，尤其是与PV株相比，其氨基酸序列同源性仅为77％。但磷酸化位点398位丝氨酸在所有毒株都是一致的，这也提示NP氨基酸序列在狂犬病毒演变中相对保守。由于NP基因高度保守且高效表达不仅可用于检测广谱的狂犬病毒感染，也作为分子和抗原性比较的对象而广泛用于狂犬病毒的分类研究中。目前NP抗原性和NP基因序列已作为狂犬病毒属分型和狂犬病毒分组的重要依据^〔32〕。

　　2．2．3　NP在狂犬病流行病学研究及控制中的作用　用抗狂犬病毒NP单抗进行狂犬病毒抗原变异的流行病学调查显示从不同的流行病学暴发中分离得到的毒株其NP抗原性常常不同，从而有可能发现抗原的变异并进一步研究变异毒株在自然界的分布和传播。Jean等^〔33〕用抗狂犬病毒NP单抗（MAb-RNPs）对来自不同地区的427株狂犬病毒进行分析，根据反应类型不同将其分组，这种分组与宿主动物和地理分布有关，并且这种反应类型的不同长时期保持稳定。进一步比较发现无论是主要宿主动物或少数其它动物分离的毒株，或将毒株经细胞或动物传代，其反应类型仍保持不变。另一个发现是比较同一地理位置主要宿主动物分离株和其它动物分离株，如果反应类型一致说明是同种病毒种间传播，如果反应类型不一致说明病毒是由其它动物传播过来的。蝙蝠狂犬病被认为是非常独立的，很少成为陆地动物狂犬病的传染来源。但一些资料表明感染的蝙蝠偶而也可将狂犬病毒传入陆地动物。例如北美一些无陆地动物狂犬病流行的地区偶然会有陆地动物狂犬病例或蝙蝠狂犬病例的报告，这些地区的动物狂犬病例可能是接触了感染的蝙蝠造成的。比较24株从这些地区分离毒株的单抗反应类型表明其中的23株来自蝙蝠，流行病学调查证明其中1匹狂犬病马和1头狂犬病牛接触过感染的蝙蝠；剩余的一株分离自纽约1只犬，该犬来自非洲，用抗病毒核蛋白单抗进行分析表明分离的毒株完全不同于以往从纽约分离的毒株，却与非洲分离株反应一致。由此可以看出抗RNP单抗反应类型的差异与病毒的宿主和地理上的差异相一致。应用这一原理，这些单抗在流行病学中也很有用，可以显示给定毒株的地理位置和与之相关的宿主动物；提供狂犬病毒株的遗传信息以及对人和家养动物潜在的暴露来源，这对狂犬病的流行病学研究和控制有重要指导意义。

　　3　狂犬病毒遗传变异性研究

　　有效的病毒-媒介结合是由于在分子，生理学及行为方面的相互适应，这种适应可以由于自然或人为的选择压力而改变，从而导致宿主种类的出现或消失。病毒所表现出来的这些改变同时也反应在分子结构上。

　　3．1　GP基因遗传变异性研究　GP基因可分为4个区：1—57位核苷酸为信号肽编码区，58—1374为膜外区编码区，1375—1440为跨膜区编码区，1441—1575为膜内区编码区，其中膜外区（氨基末端）较膜内区更为保守一些。比较我国人用疫苗株（aG）和国际标准攻击毒株（CVS）、巴斯德株（PV）糖蛋白基因核苷酸序列^〔34〕，同源性最大的区域是膜外区（92．8％），最小的是膜内区（78％）。Tordo等根据G基因氨基末端500个核苷酸序列再次对狂犬病毒属进行分类，基因1—4型与血清1—4型一致，基因5和6型与EBL1和EBL2一致。

　　目前还不清楚特异性狂犬病毒血清型是否与特异性疾病形式有关。Mokola病毒引起的疾病其病理表现完全不同于血清一型的街毒株，如：罕见的广泛围脑膜脑炎，但感染组织中尼氏小体数量很少。单克隆抗体研究及交叉保护实验证实Mokola病毒是狂犬相关病毒中与血清一型疫苗株相关最大的一种，分子流行病学调查也证实了这一点。用抗糖蛋白单抗筛选出的CVS—11变异株免疫动物不能保护动物抵抗CVS—11原形株的攻击。用传统狂犬病疫苗免疫的鼠，再用死亡病人分离的毒株攻击，出现了一些免疫失败病例。目前已认识到不同毒株间抗原性结构各有不同，它们仅在NP抗原性上较为一致，GP抗原构和保护力方面存在差别。比较狂犬病毒属中基因型差异较大的2个代表毒株，即狂犬病毒和Mokola病毒基因组，其同源性按下列顺序递减：NP（80％），M2（76％），GP（58％）及M1（45％）^〔35〕，在免疫原部位的变异可以解释在血清一型疫苗株和其它型毒株之间缺乏交叉保护的原因。

　　目前认为Arg333是决定GP毒力的关键残基。但病毒与受体的相互作用是极其复杂的。在基因Ⅰ型病毒中，神经毒似乎直接与333位精氨酸或赖氨酸的存在有关，该位置氨基酸的突变则不能感染一定类型的神经原，推测原因是突变后不能识别受体。然而高度致神经病变的Mokola株却在333位有一天门冬氨酸残基。明玉文等^〔36〕将aG糖蛋白膜外区基因进行了克隆和序列分析，发现其成熟肽推导的182位和183位的Asn和Pro分别被Ile和Len所替代，导致了AchR结合序列的构象改变，认为可能是造成aG毒力减弱的分子基础，提示组织特异性可能是非常复杂的。

　　3．2　NP基因遗传变异性研究　Kissi等比较了6个不同基因型代表毒株的N基因序列发现有两个区域的同源性水平低于平均数：1080—1278核苷酸（共199个硷基）区域和位于99—405核苷酸之间的区域，这也是变异最大的区域。通过种系发生树显示的分支结果与原有的基因分型^〔35〕相一致。不同基因型其核苷酸和氨基酸水平的同源性分别低于79．8%和93．3％。在同一基因型中（基因Ⅰ型）的不同毒株（共54株）之间核苷酸水平的平均差异是9．6％种系发生树可以将其分为至少11个不同的基因谱系，这些谱系与这些毒株的地理位置和宿主种类直接相关。进一步研究高变异区的400个核苷酸和完整的N基因绘制的种系发生树可以准确定出每一谱系的宿主和分布范围。推导出的氨基酸序列表明在核苷酸水平的变异区在氨基酸水平存在于同样的位置。到目前为止，在所有研究的狂犬病毒中有一个共同特征，即NP基因以及与其相邻的非编码区共有3个高变异区：编码NP的氨基末端和羧基末端，中间为高度保守区域^〔37〕，这与Kissi的研究结果相一致；第三个区域即变异最大的区域是N基因mRNA3’端编码区、N-M1基因间区和M1 mRNA5’端非编码区并且包括转录信号^〔38〕。这种高变异率还存在于G-L间区^〔39〕，在狂犬病基因组非编码区核苷酸的高度变异与对这些区域的不严格要求和无意义变异有关^〔40〕。但是，这种硷基的替换并非随意的，无论是对编码区或非编码区分析基础之上得出的种系发生相似性也支持这种观点^〔41〕，这提示这种选择压力同样对结构有所要求。Jean等^〔42〕分析了87个毒株的N基因中200个核苷酸，这种有限的N基因序列分析同样证明不同毒株间的流行病学关系可以从其核苷酸序列中反应出来，并且不同组病毒之间序列差异的程度与它们之间亲缘关系的远近有关。

　　相信随着新的科学知识与技术的发展和应用，有关狂犬病流行、致病、诊断和预防的分子机理将会得到更多的揭示，从而使狂犬病的预防和控制工作更有成效。

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1998年6月16日收稿