多种方法对广西地区健康犬带狂犬病毒的调查

中国人兽共患病杂志 1999年第3期第15卷 调查防制

作者：徐葛林　吴　杰　吴泰才　薛红刚　郑新雄　刘锦彦　郭宁贞　朱家鸿

单位：徐葛林　吴　杰　薛红刚　郑新雄　刘锦彦　朱家鸿　卫生部武汉生物制品研究所（武汉，430060）；吴泰才　郭宁贞　广西地区卫生防疫站

　　近十几年来，随着我国人民生活水平的提高，养狗成为一种时尚，且数量越来越多，因此我国很多地区常有狂犬病散发和流行，我国狂犬病的主要宿主是犬，在人狂犬病的所有病例中，99％以上是由犬传播病毒引起的。国内曾有人对健康犬脑中狂犬病毒带毒率情况作了调查^〔1〕，但仅采用免疫荧光法检测，未进一步应用其他手段验证。WHO指出：分离病毒对证实狂犬病毒抗原检测结果可能是必要的^〔2〕。本文中我们采用免疫荧光法、免疫荧光阻断法、夹心ELISA并结合小鼠颅内接种法对外观健康犬犬脑进行狂犬病毒的特异性检测及病毒分离，并验证我室研制的检测狂犬病毒抗原的免疫荧光试剂以及夹心ELISA试剂盒的特异性和灵敏度，为我国犬中狂犬病流行情况调查及今后对狂犬病毒分离株的进一步鉴定奠定了基础。

　　 1　材料和方法

　　1.1　狂犬病毒标准攻击毒株CVS　我室保存。

　　 1.2　抗狂犬病毒糖蛋白及核蛋白单克隆抗体腹水　我室制备^〔3〕。

　　1.3　荧光标记羊抗鼠IgG抗体　由我所免疫研究室提供。

　　 1.4　样品来源及处理　取广西地区1996及1997年度在市场屠宰出售的外观健康犬犬脑102只，其中采自玉林的有21只、隆林10只、西林13只、田林7只、宁明21只、柳州21只、北流9只，取海马回及脑干部位，轻压印片，自然干燥后，丙酮室温固定10min，-20℃保存备用，并将部分组织冻存，余者加生理盐水研磨成10％悬液后备用。

　　 1.5　小鼠颅内接种　取少量上述犬脑悬液以生理盐水稀释至1％浓度，小鼠颅内注射6～8g，每份样品接种4～6只，0.03ml/只，连续观察21天，记录小鼠发病症状及存活情况。

　　 1.6　免疫荧光试验　取上述脑印片，加1∶2000稀释的4株抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体腹水混合物，同时设只加生理盐水的脑印片作空白对照，37℃湿盒孵育45s，生理盐水漂洗3次后吹干，加工作浓度的荧光抗体37℃湿盒孵育30s，生理盐水漂洗3次后，甘油封片镜检，并设CVS感染的小鼠脑作阳性抗原对照，以胞浆中有荧光颗粒者为狂犬病毒阳性，无荧光者为阴性。

　　 1.7　免疫荧光阻断实验　取上述抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体腹水稀释成1∶1000，加等体积的10％CVS感染的小鼠脑悬液，37℃水浴中和1h，并设单抗与正常小鼠脑悬液的中和对照，同上法滴加待测脑印片上作免疫荧光试验。若正常鼠脑悬液的中和对照出现为荧光阳性，而CVS鼠脑悬液与单抗的中和产物无荧光颗粒者为狂犬病毒阳性；若二者均无荧光者为狂犬病毒阴性；若二者均有荧光，则为非特异性。

　　 1.8　夹心ELISA试验　取样品脑悬液，甲醛灭活后，倍比稀释，加入预先用抗狂犬病毒单抗混合物包被的96孔酶标板孔中，以抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体酶结合物作夹心ELISA试验^〔4〕，同时设正常小鼠脑10％悬液作阴性对照，CVS感染的小鼠脑悬液10％作阳性对照。样品OD值高于阴性对照OD值的3倍即为狂犬病毒阳性。

　　 1.9　小鼠中和试验　取免疫荧光、小鼠颅内接种及夹心ELISA为阳性的犬脑样品作小鼠中和试验，取抗狂犬病毒糖蛋白单抗腹水稀释成54.0 IU/ml,与1∶100稀释的犬脑样品悬液等量混合，作试验组；同时设生理盐水代替单抗与样品中和作试验对照组；并设CVS感染鼠脑悬液分别与单抗和生理盐水中和，分别作阳性对照A、B组；设正常小鼠脑悬液与单抗中和，作阴性对照组。37℃水浴中和1h，每份样品颅内注射6只10～12g小鼠，0.03ml/只，连续观察21天，记录小鼠发病症状及存活情况。

　　 2　结果

　　2.1　小鼠颅内接种　102份犬脑样品颅内接种102组小鼠后，有4组小鼠于接种后第11～14天时出现竖毛、拱背、转圈等典型狂犬病症状，其中1组表现为麻痹型，其余3组表现为狂躁型，该4组小鼠于发病后1～2天死亡。

　　 2.2　免疫荧光试验　102份犬脑印片作免疫荧光试验，在空白对照及阳性对照成立的前提下，有4份样品表现为荧光阳性，胞浆中可见大小不均的荧光颗粒，见封3图。

图1 1例免疫荧光阳性的健康犬脑印片

　　Figure1 The immunogluorescent staining result of 4

　　positive canine brains

　　2.3　免疫荧光阻断试验　102份犬脑印片作免疫荧光阻断试验，有4份为狂犬病毒阳性，其余则为阴性。

　　 2.4　夹心ELISA试验　试验检测了102份犬脑样品，在空白及阴阳性对照成立的前提下，有4份脑样品为阳性，稀释度范围为1∶20～1∶80，见表1。

表1　夹心ELISA检测广西健康犬脑样品结果统计

　　Table 1 The results of sandwich ELISA detecting canine brains from Guangxi

　　2.5　小鼠中和试验　小鼠中和试验结果表明，CVS与单抗中和的阳性对照A组小鼠全部存活，而CVS与生理盐水中和的阳性对照B组小鼠全部发病死亡，正常小鼠脑与单抗中和的阴性对照小鼠全部存活，小鼠颅内接种、免疫荧光试验、免疫荧光阻断试验以及夹心ELISA均为阳性的4份犬脑样品与生理盐水中和的试验对照组小鼠全部死亡，而该4份样品与狂犬病毒糖蛋白单抗中和的试验组小鼠有1组小鼠全部存活；另1组6只小鼠发病死亡2只；其余2组小鼠每组6只小鼠各发病死亡1只，试验结果进一步验证了该4份犬脑样品的确为狂犬病毒阳性。3　讨论

　　狂犬病毒特别是狂犬病街毒的试验室诊断试剂在我国尚属空白，我们根据世界卫生组织对狂犬病试验室诊断的基本要求，参考了WHO狂犬病研究和参考中心（法国巴斯德研究所）H.Bourhy博士等的专著《狂犬病试验室技术》^〔5〕，结合我国的具体情况，利用自制的狂犬病毒单克隆抗体研制出了用于检测狂犬病毒抗原的免疫荧光诊断试剂和夹心ELISA诊断试剂。通过对广西地区健康犬脑中狂犬病毒带毒情况的调查，结合常规的病毒分离及鉴定的小鼠颅内接种法，进一步验证了狂犬病毒抗原诊断试剂的可靠性，为今后我国狂犬病毒的流行病学监测工作的开展创造了条件。

　　本文采用小鼠颅内接种、免疫荧光试验、免疫荧光阻断试验、夹心ELISA以及小鼠中和试验详细调查了102份广西地区外观健康犬脑样品，结果表明有4份为狂犬病毒阳性，该4份样品中，1份是采自中越边界宁明的4月龄狗脑样，另3份均是采自柳州的重约9kg的越南狗脑样，总检出率为3.92％（4/102）。小鼠中和试验结果表明，其中1份被狂犬病毒糖蛋白单抗完全中和，另3份则不完全中和，揭示其中和滴度与标准攻击毒株CVS不完全相同，其抗原性之间的差异有待进一步研究。

　　本次研究结果表明在我国健康犬中，确实存在有狂犬病毒感染但宿主不发病的情况，从而进一步验证了有关专家提出的健康犬带毒、排毒且具感染性的推断，因此必需大力推广在犬、猫等动物中接种狂犬病疫苗的工作；凡被犬咬伤者，无论犬是否健康，均需注射狂犬病疫苗。

　　本研究中，为了提高检测的灵敏度，我们选用狂犬病毒易于富集的海马回和脑干组织印片或匀浆检测。在作免疫荧光试验时我们发现，若印片较厚，荧光染料易非特异性沉着于堆积的组织中造成假阳性，此时空白对照亦有荧光颗粒。若将此脑样品重新轻压印片作免疫荧光，非特异性荧光颗粒即消失，证明为狂犬病毒阴性，这表明检测结果与印片的技术水平密切相关。因此，为提高诊断的准确性，必须设单抗的空白对照试验，只有在空白对照无荧光颗粒的前提下，结果的判定才是有效的。应强调的是，宜用2种不同的方法平行检测样品中狂犬病毒，以验证彼此的结果。

　　4种方法的检出率相同，结果完全相符，表明免疫荧光、免疫荧光阻断试验以及夹心ELISA完全适用于狗脑样品的试验室诊断，而且快速简便，其灵敏度与特异性均与小鼠颅内接种试验相符，与之相对应的以狂犬病毒单抗为基础研制的免疫荧光试剂以及夹心ELISA试剂盒可望用于试验室常规诊断。

　　4　参考文献

　　1.杜福，等.广东省犬带狂犬病毒调查.中国人兽共患病杂志，1992,8(2):39.

　　2.郑海发，等译.世界卫生组织狂犬病专家委员会第八次报告.中国药品生物制品检定所，1995,10.

　　3.徐葛林，等.抗狂犬病毒糖蛋白及核蛋白单抗的研制及应用.中国生物制品学杂志，1996，9(1):23.

　　4.徐葛林，等.狂犬病毒街毒抗原的快速检测.中国人兽共患病杂志，1998,14(1):50.

　　5.H Bourhy,et al.Laboratory methods for rabies diagnosis. Institut Pasteur,Paris.1991,42～53.

收稿日期：1998年6月23日　修回日期：1998年8月30日