1例长潜伏期狂犬病病例的实验检测研究

中国人兽共患病杂志 1999年第5期第15卷 实验研究

作者：沈蕊华　丁晓光　张金芳　刘敏勇　伍稚梅

单位：上海市疾病预防控制中心(上海，200000)

　　关键词： 狂犬病；狂犬病病毒；抗原检测；病毒分离

　　摘　要　本文报道1例临床狂犬病病例，男性22岁，发病3天出现三恐症状，继而四肢撑于床上，口中流涎，呼吸循环衰竭死亡。追述病史，8岁时曾被犬咬伤左臂，留有疤痕，当时未作处理，以后未密切接触过犬或与犬类有关的食品和物品。为确诊长潜伏期的狂犬病，采取一系列实验研究，采集死者脑海马回，应用单克隆抗体(McAb)作酶联免疫反应和免疫荧光检测病毒抗原，仅几小时即检测到病毒抗原，达到快速诊断。为确证检测结果，用细胞培养和动物接种分离病毒，获得病毒株，并进一步鉴定。从而为长达14年潜伏期的狂犬病病例找到了病原，对防病措施的落实提供了依据。

STUDY ON A WITH PATIENT RABIES IN A LONG INCUBATION PERIOD

Shen Ruihua Ding Shaoguang Zhang Jinfang Lin Minyong Wu Zhimei

(Shanghai Centre of Disease Control,Shanghai,200031)

　　ABSTRACT　　A 22 years old rabies patient who was afraid of wind,water,light,and was died of circulatory failure.14 years ago he was bitten by a dog on left arm remaining a scar and did not inject rabies vaccine.

　　In order to determine the rabies patient,a series of experiments were carried out.The brain was collected and the brain smear was made.ELISA and IFA were detected by McAb.In a couple of hours the rabies virus antigen were found.Meanwhile the virus isolate were tested by inoculation of brain suspension into N₂A cell culture and mice brain. After 48 hours of inoculation,the evidence of positive result was shown in the cell plasm by IFA and the titer was 10^-5.The rabies virus strain was obtained by mice isolation in 2 passages.These experiment results confirmed a rabies patient with long incubation period.

　　KEYWORDS　　Rabies virus Antigen test Virus isolation

　　狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的致死性人畜共患的传染病。人类狂犬病的90%以上由犬传播。临床以恐水、畏光和怕风、狂躁为主。一般发病致死日程为3天～1周。潜伏期一般为15天～半年。本文报道1例潜伏期长达14年。以单克隆抗体检测与常规病毒分离结合，得到了快速诊断，并获得了稳定传代的病毒株，报告如下：

　　1　材料和方法

　　1.1　病史资料　收集临床诊断为狂犬病的资料。

　　1.2　标本的收集与处理　无菌操作取死者脑组织海马回3g,冷链至实验室，常规制脑悬液和脑印片，低温保存。

　　1.3　病毒抗原检测

　　1.3.1　ELISA夹心法　通过检测脑组织中的狂犬病病毒衣壳来获得诊断结果。将1∶4000稀释的标本加入用抗狂犬病病毒核衣壳的McAb 1∶500稀释的包被孔内，再与酶标的McAb结合，加入二种底物显色。用肉眼观察颜色反应或用酶标仪测光吸收值，与阴、阳性对照比较，即可得出有无狂犬病病毒抗原的结论。试剂由武汉生物制品研究所惠赠。

　　1.3.2　免疫荧光检测　脑印片的直接免疫荧光检测(试剂由法国巴斯德研究所惠赠)：抗狂犬病病毒核衣壳McAb与荧光素偶联，在直接法中可特异地与脑印片中的狂犬病病毒包涵体结合发出特异性荧光。

　　脑印片的间接免疫荧光检测(McAb由武汉生物制品研究所惠赠)：将脑印片与不同稀释度1∶200～1∶800 McAb 结合后再与抗鼠荧光抗体结合产生特异性荧光。上述实验均设阴、阳性对照。

　　1.4　病毒分离和鉴定

　　1.4.1　N₂A神经瘤细胞和动物培养狂犬病病毒与鉴定　方法参照法国巴斯德研究所提供的方法略加改良^［1］。

　　1.4.2　细胞中和试验　用BHK/BSR细胞和兔免疫血清常规进行。

　　2　结　果

　　2.1　临床诊断　患者男性，22岁，海南人，就读于上海交通大学，以右侧胸痛，精神异常3天入院。体检左臂有8岁时被犬咬伤的疤痕，双侧巴氏征阳性。当天下午，患者明显气急。继而出现恐水、恐声、恐光症状，四肢撑于床上，口中流涎，最终呼吸循环衰竭死亡。

　　入院时病人追述病史、14年前被犬咬伤后未作任何处理，以后没有密切接触过犬类或与此有关的物品。

　　根据被犬咬伤史、临床表现、临床诊断为狂犬病。

　　2.2　快速检测到病毒抗原

　　2.2.1　ELISA检测到病毒抗原　McAb夹心法检测抗原全过程仅需3 h，设阴、阳性对照。患者的脑悬液标本与正常脑悬液具有明显的区别(见表1)。标本与阳性对照均显示强黄色和盐色，阴性对照完全无色。根据结果显示患者脑组织含有狂犬病病毒抗原。

表1ELISA检测狂犬病毒抗原

　　Table 1 Rapid rabies enzyme immunodiagnosis(ELISA) for rabies virus antigen detection

　　* 9326 为1993年检测到的狂犬脑悬液　　本方法运用分子克隆技术获得的抗核衣壳MaAb，在夹心法中标本里含有的微量狂犬病病毒抗原与McAb结合，显示其特有的颜色，具有特异性强，敏感性高的特点。而正常脑组织缺乏此抗原，显示无色为阴性。

　　2.2.2　免疫荧光检测到病毒抗原　将抗狂犬病病毒核衣壳McAb运用于直接和间接免疫荧光法，镜下显示患者脑海马回印片和阳性对照脑印片细胞浆中嵌入大量针尖状或点状明亮的苹果绿或草绿色颗粒，在其周边有较强烈的染色者为尼氏小体。看到象沙子或灰尘的较细小的包涵体以及丝状包涵体，为含病毒颗粒的神经元或树突。

　　阴性对照标本不包含任何典型的包涵体的特异性荧光颗粒，为一片均匀的暗色，偶尔有几点浮在上面的游离荧光素。见照片，见表2。

表2McAb免疫荧光直接法和间接法检测患者脑印片

　　Table 2 McAb direct and indirect immunofluorescent testing case brain smear

　　注：阳性对照由法国巴斯德研究所提供，阴性对照为正常脑组织印片3　病毒分离和鉴定

　　3.1　N₂A神经瘤细胞培养分离，免疫荧光检测到病毒抗原　经微量培养的成片神经瘤细胞N₂A加入10^-1～10^-8不同稀释度的标本液，在CO₂培养下，第一代48h作直接荧光检测，见细胞浆内大量针尖状或点状特异性荧光颗粒。对照成立。病毒抗原滴度达到10^-5。由此显示，N₂A细胞可作为培养病毒的一个重指标，虽然细胞病变在48h时不明显，但免疫荧光清晰，比动物培养快速。它必须具备2级生物安全标准和部分3级标准，因此通过接种动物来分离病毒的方法一直被运用。

　　3.2　动物培养分离鉴定获得病毒株　将标本接种3周小白鼠和乳鼠，动物分别于接种后第8天和第9天发病，于第9天和第15天死亡，对照成立。继续传代，小白鼠于接种后第9天、乳鼠于第11天死亡。见表3。

表3小白鼠和乳鼠分离病毒和荧光法鉴定

　　Table 3 Identification of virus isolation and immunofluorescent test(IFA) by mice and suckling mice

　　3.3　BHK/BSR 细胞中和试验　将标本由10^-1～10^-8稀释接种于BHK/BSR细胞37℃ CO₂培养，7d CPE(+)，滴度为10^-5，按TCD50稀释，使每0.1ml中含100TCD50病毒量，则为10^-3稀释。将兔免疫血清作1∶5四倍递增稀释，与稀释的病毒液充分混合，37℃水浴1h，接种BHK/BSR细胞，同法培养，逐日观察CPE，设病毒对照，其它病毒对照、细胞对照、血清对照。结果见表4。

表4细胞病变法血清中和试验

　　Table 4 Serun neuralization test incytopathic effect(CPE)

　　表4显示：分离获得的狂犬病病毒中和抗体效价为＞1∶1280，对照成立。* -:表示无CPE，** +：表示有CPE。4　讨　论

　　据文献报道，狂犬病的潜伏期最长为20多年，国内外属罕见。本文报告这例长达14年潜伏期的狂犬病病例，在本市为首例，为国内罕见。

　　为确诊狂犬病运用了一系列实验技术。应用McAb ELISA和免疫荧光技术检测患者脑中的病毒抗原，2～3h内便获得结果，这是快速诊断的理想方法，比作病理切片检测内基氏小体方法简便而快速。病毒分离也可能是必需的：1，可用来确诊抗原检测的结果。2，对分离物可作进一步鉴定和分析。3，可获得稳定传代的毒株，为以后的研究打下基础。本实验运用抗狂犬病病毒Ⅰ型的McAb作检测分析获得阳性结果。因此，根据患者的被犬咬伤史、临床症状以及几种检测方法的结果，确诊为Ⅰ型狂犬病。

　　从本病例显示，加强对暴露者的及时处理非常重要，加强对被犬咬伤者接种疫苗后的观察，及时检测抗体水平，使免疫者达到保护力。加强犬类管理。这样就能预防控制狂犬病。

　　(上海医科大学病理教研组对狂犬病死者取脑组织标本，上海第五人民医院提供病史有关资料，闵行区卫生防疫站组织调查，武汉生物制品研究所、巴斯德研究所提供试剂等，特此一并致谢)

　　5　参考文献

　　1.WHO GenevaLaboratory techniques in rabies 1996,80～112.

　　2.Laboratory methods for rabies diagnosis-Institat Pasteur.1997,162～180.

　　3.任稚梅，等.上海市1950～1995年控制狂犬病的工作.中国计划免疫，1997，3(3)：10.

　　4.唐青，等.狂犬病分子生物学及遗传变异研究进展.疾病监测，1998，13(8-A)：142.

　　5.严家新，朱家鸿.狂犬病毒分子流行病学研究进展.国外医学病毒分册，1995,2(2):34.

1999年1月3日收稿　1999年5月4日修回