卵母细胞单精子显微注射治疗男性因素及不明原因不育156个周期临床分析

中华妇产科杂志 1999年第1期第0卷 专题研究

作者：李蓉　庄广伦　周灿权　张敏芳　李满

单位：510080 广州，中山医科大学第一附属医院妇产科

关键词：卵母细胞；受精；体外；胚泡移植；不育；男（雄）性；不育；女（雌）性

　　编者按　本期刊出的以下两篇论文报道了两种新助孕技术，适用于男性因素(少、弱精症)及不明原因不育症。中山医科大学第一附属医院生殖医学研究中心在传统的体外受精-胚胎移植(IVF-ET)工作基础上，开展了卵母细胞单精子显微注射(ICSI)技术，为男性不育患者带来了福音。随操作例数增多，技巧更趋熟练，对卵子创伤减少，形成的胚胎质量好，从而提高了临床妊娠率。第一军医大学南方医院妇产科应用经阴道配子输卵管移植(TV-GIFT)技术，从阴道插管进入输卵管移植卵子及200 000个精子，虽然仍在初期试验阶段，而23个周期的临床妊娠率已达21.7%。与以往应用的经腹配子输卵管内移植比较，此技术较简单，对患者创伤小、安全、价格便宜且有效，值得开展，并进一步熟练操作。在此，我们向作者祝贺，学习他们勇于开拓、抓住重点、不断上进的精神。他们的成功是和单位领导的支持与人员的培训分不开的。

　　【摘要】　目的　阶段性回顾应用卵母细胞单精子显微注射（ICSI）技术治疗严重男性因素及不明原因不育的临床效果。方法　收集1995年12月20日至1998年1月16日，在我院生殖医学研究中心接受ICSI技术治疗的严重男性因素及不明原因不育患者140对(156个周期）为研究对象，以1997年5月28日为分界点，将其前的74个周期划为第一阶段，其后的82个周期为第二阶段，分析比较两阶段的临床结果。采用常规超排卵方案治疗，成熟卵母细胞行单精子显微注射。没有无核碎片及无核碎片＜20%为A类胚胎。结果　两个阶段的成熟卵母细胞数和卵裂率差异无显著性，但注射后存活卵子数、正常受精数、卵裂球的质量和临床妊娠率,第二阶段分别为703个(89.5%)、487个(69.3%)、A类胚胎占74.2%和36.6%，较第一阶段的592个(85.1%)、388个(65.5%)、A类胚胎占66.0%和27.0%，有显著性提高。结论　ICSI的操作直接影响胚胎质量，随着ICSI技术的不断成熟和完善，其在治疗男性因素及不明原因不育中的作用是肯定的。

　　The Evaluation of 156 Cycles of Intracytoplasmic Sperm Injection in the Management of Male Infertility and Idiopathic Infertility　LI Rong， ZHUANG Guanglun， ZHOU Canquan，et al. First Affiliated Hospital of Sun Yet-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080

　　【Abstract】　Objective　 The aim of this study was to examine, retrospectively, the efficacy of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in the treatment of male infertility and idiopathic infertility.Methods　From November 1995 to January 1998,140 couples (156 cycles) received ICSI because of severe male factor infertility or idiopathic infertility in our assisted reproductive technology center. The treatment cycles were divided into two groups, group Ⅰ included 74 cycles done before May 1997, group Ⅱ included 82 cycles done after May 1997. Mature oocytes were selected for microinjection.Results　No differences were observed between the two groups in the number of mature oocyte and the total cleavage rate. Oocyte survival rate, normal fertilization rate, embryos of good morphology rate and clinical pregnancy rate were significantly higher in group Ⅱ than that in group Ⅰ.Conclusion　ICSI procedure does affect the quality of embryos. With the improvement of ICSI technique, ICSI should be the treatment of choice for male infertility and idiopathic infertility.

　　【Key words】　Oocytes　　Fertilization in vitro 　　Embryo Transfer　　Infertility, male　　 Infertility, Female

　　自1995年12月，我院生殖医学研究中心开始采用卵母细胞单精子显微注射（intracytoplasmic sperm injection,ICSI)技术，治疗严重男性因素及不明原因不育患者，1996年10月国内首例ICSI试管婴儿在我院诞生^［1］。至1998年1月16日，140对严重男性因素或不明原因不育夫妇在我中心采用ICSI技术治疗了156个周期，现将结果报道如下。

资料与方法

　　一、研究对象

　　1995年12月20日至1998年1月16日，在本中心接受ICSI技术治疗的因严重男性因素及不明原因不育患者140对（156个周期），女方年龄(31.2±3.8)岁(±s,下同)(23～42岁)，男方平均年龄为(33.9±4.8)岁(26～54岁)，平均不育时间为(6.3±2.8)年(2～15年)。以1997年5月28日作为分界点，将此前的74个周期划为第一阶段，其后的82个周期划为第二个阶段。全部一开始即进行ICSI治疗。

　　156个周期中,严重少、弱、畸形精子导致的不育为92例，不明原因不育为33例，无精症不育为31例。按WHO标准评估精液指标^［2］，严重少、弱、畸形精症至少满足下列条件之一：(1）精子浓度＜2×10⁹/L；(2)精子浓度＜20×10⁹/L,直线活动率＜50%和(或)正常形态精子＜30%。不明原因不育包括22例前次常规体外受精(IVF)周期受精率＜20%以及11例本周期常规IVF受精失败者。取卵后24小时行单精子显微注射受精。阻塞性无精症患者睾丸活检有生精功能。

　　所有行ICSI受精的患者染色体和性激素检查均为正常。

　　二、方法

　　1.控制性超排卵：采用本中心常规体外受精-胚胎移植（IVF-ET）超排卵方案^［3］，但注射hCG时最大主导卵泡径线较常规IVF-ET患者的大1～2 mm，B超介导下经阴道取卵。

　　2.精液的处理：注射hCG前1～2天，嘱患者排精1次，显微注射前1小时取精子。无精症患者采用显微手术经附睾取精，如无法找到精子，则经睾丸活检取精。采用Percoll梯度离心法、直接离心法或沉淀法。

　　3.卵母细胞处理：取卵后4～6小时用质量浓度为80 kIU/L的透明质酸酶（TypeVIII，美国Sigma公司产品）消化卵丘，去卵丘后选择有第一极体的成熟卵母细胞进行ICSI受精。

　　4.显微操作：见参考文献［1］，采用英国RI公司显微操作仪系统，配以Olympus倒置显微镜，在放大200倍下进行显微操作，显微操作的两个基本点是：(1)精子制动：选择形态正常的活动精子，用显微注射针压拉精子尾部，直至其丧失活动力；(2）确保精子进入卵母细胞胞浆：携带精子的显微注射针进入胞浆后，回吸部分胞浆直至卵膜穿破，然后将精子连同被回吸的胞浆一起注入卵母细胞胞浆。这两点在第二阶段有所改进，精子制动采取反复压拉代替一次性压拉，精子注入胞浆之前，胞浆抽吸在一定程度上重复数次。精子注射选择对纺锤体损伤较小的部位。

　　5.胚胎质量评估和胚胎移植：显微注射后16～18小时检查受精情况。正常受精的标准：见到两个独立的或有碎片的极体的同时，有两个清晰的原核。ICSI后两天，检查胚胎质量，根据无核碎片占整个胚胎的比例，将胚胎质量分为4级^［4］，Ⅰ级：没有无核碎片；Ⅱ级：无核碎片＜20%；Ⅲ级：无核碎片＞20%，但＜50%；Ⅳ级：无核碎片＞50%。本研究中将Ⅰ级和Ⅱ级胚胎为A类胚胎，Ⅲ级和Ⅳ级胚胎为B类胚胎。根据Van Steirteghem等^［5］的标准，无核碎片＜50%的胚胎可予以宫腔内移植，无核碎片＜20%的胚胎适宜冷冻保存。移植胚胎数不超过4个。

　　6.临床妊娠检查：胚胎移植后两周行尿妊娠试验检查，妊娠7周行B超检查，见到胎心音，为临床妊娠。

　　三、统计学方法

　　采用χ²检验。

结果

　　156个周期共取卵1 784个，其中可注射的成熟卵母细胞数1 481个(83.0%)，其他的17.0%卵母细胞为M₁期卵母细胞或生殖泡卵母细胞。注射后存活卵子为1 295（87.4%），另外186个卵母细胞在注射过程中受到损伤而死亡。875（67.6%）个存活卵子正常受精，其余存活卵子不受精或发生异常受精与孤雌受精。787（89.9%）个正常受精的胚胎发生卵裂，其中A类胚胎为556（70.6%），B类胚胎为231(29.4%)。临床妊娠例数为50例（32.5%），其中12例已分娩，7例流产（14.0%）。见表1。

表1　156个ICSI治疗周期受精率、卵裂和妊娠情况

　　第一、第二阶段的成熟卵母细胞分别为696个（82.1%）和785个（84.0%），两者比较，差异无显著性(P＞0.05)。第二阶段注射后存活卵子为703个（89.5%），显著高于第一阶段的592个（85.1%）（P＜0.01）。第二阶段的正常受精数为487个（69.3%），亦显著高于第一阶段的388个（65.5%）（P＜0.05）。两个阶段的卵裂分别为341个（87.9%）和446个（91.6%），两者比较差异无显著性（P＞0.05）。但两个阶段的胚胎发育质量差异有显著性，第二阶段的A类胚胎占74.2%，显著高于第一阶段的66.0%（P＜0.01）。第二阶段的临床妊娠率为36.6%，显著高于第一阶段的27.0%(P＜0.01)。因流产例数较少，未行统计学分析。

讨论

　　一、稳定的常规IVF-ET环境是临床应用ICSI技术的基本保证

　　获得一定数量的成熟卵母细胞提供显微注射，临床控制性超排卵特别是注射hCG时机的掌握，至关重要。两个阶段的成熟卵母细胞数经统计学处理未见显著性差异，提示我中心常规IVF-ET环境比较稳定，进而保证ICSI技术在临床的应用。

　　二、显微注射的操作直接影响ICSI的结果

　　研究显示，注射精子之前，一定程度的抽吸胞浆直至卵膜穿破，则ICSI受精率有明显提高。抽吸胞浆的过程也就是对卵母细胞的机械性刺激过程，进而引发胞浆内钙离子流的释放^［6］。本资料第二阶段的显微操作过程中，在保证卵膜穿破的同时，尽量轻柔的重复抽吸胞浆，充分保证卵母细胞的激活，受精率有明显提高。

　　精子制动过程是部分破坏精子尾部胞膜，确保精子进入卵母细胞胞浆后释放精子蛋白以激活卵母细胞。第二阶段的显微操作过程中，反复压拉精子尾部，受精率亦有明显提高。

　　精子注射部位的不同，对胚胎质量有不同影响^［7］。本资料第二阶段的显微操作过程中，精子注射选择对纺锤体损伤较小的部位，故胚胎质量有明显提高。

　　基于上述技术的改进，第二阶段的临床妊娠率有显著提高。由此可见，显微注射技术的改进和完善，将直接影响着ICSI受精、胚胎发育和临床妊娠的结果。

　　三、ICSI的临床应用价值

　　1992年人类首例ICSI试管婴儿诞生以来，至今全球范围内各生殖中心总共行ICSI已有35 000个周期，妊娠10 319例，已出生ICSI试管婴儿5 352个，我中心治疗的156个周期中，50例临床妊娠，其中12例已分娩，未见大体畸形。因此，在稳定的常规IVF-ET环境的保证下，随着ICSI技术的不断成熟和完善，其在治疗男性因素及不明原因不育中的应用是肯定的。

　　 参考文献

　　[1]　李蓉，庄广伦，张敏芳．卵母细胞单精子显微注射治疗男性因素及不明原因不育．中华妇产科杂志， 1997，32：211-213.

　　[2]　World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction, 3rd ed. Cambridge: Cambridge University Press, 1992.10-15.

　　[3]　庄广伦,周灿权,张秀俊,等.体外受精-胚胎移植34例报告.生殖医学杂志， 1992，1:24-26.

　　[4]　Candido T, Mauri O, Leena T, et al. Low pregnancy rate is achieved in patients treated with intracytoplasma sperm injection due to previous low or failed fertilization in in-vitro fertilization. Hum Reprod, 1998,13:65-70.

　　[5]　Van Steirteghem AC, Van der Elst, Van den Abbeel E, et al. Cryopreservation of supernumerary multicellular human embryos obtained after intracytoplasma sperm injection. Fertil Steril, 1994,62:775-780.

　　[6]　Vanderzwalmen P, Bertiin G, Lejeune B, et al. Two essential steps for a successful intracytoplasma sperm injection: injection of immobilized spermatozoa after rupture of the oolema. Hum Reprod， 1996，11:540-547.

　　[7]　Nagy ZP, Liu J， Joris H, et al. The influence of the site of sperm depposition and the mode of oolema breakage at intracytoplasma sperm injection on fertilization and embryo development rates. Hum Reprod， 1995，10:3171-3177.

(收稿：1998-03-02　　修回：1998-10-20)