大鼠肝癌前病灶与卵圆细胞的关系

中华病理学杂志 1998年第2期第0卷

作者：廖钢陵　陈晋彦　丁濂　张彦东

单位：100005　北京，中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学院病理室［廖钢陵（生物物理室）、陈晋彦、丁濂、张彦东］

关键词：肝肿瘤，实验性；癌前状态；放射自显影；卵圆细胞

　　【摘要】　目的　探讨肝脏癌前病灶的细胞学起源。方法　用雄性Fisher 344大鼠，在两个不同的化学致癌模型中，用放射自显影方法追踪癌前病灶的发生与卵圆细胞（oval cell）或肝细胞的关系。模型Ⅰ动物连续饲喂含0.02%二乙酰胺基芴（2-AAF）共28天，第7天作2/3肝大部切除（2/3 PH）以刺激卵圆细胞增生，第12天用³H-Tdr腹腔注射以选择性标记卵圆细胞；模型Ⅱ在28天连续饲喂0.02% 2-AAF之前第9天，先进行2/3PH,术后22小时用³H-Tdr腹腔注射以标记代偿性增生的肝细胞。结果　模型Ⅰ与模型Ⅱ在癌前病灶出现之前分别获得了对卵圆细胞和肝细胞的选择性标记，而癌前病灶细胞核内的示踪银颗粒只出现在卵圆细胞被选择性标记的模型Ⅰ中。结论　提供了大鼠以2-AAF为致癌物诱发的癌前病灶来自卵圆细胞的直接证据。

　　Relationship between oval cells and preneoplastic lesions induced by 2-acetylaminofluorine in rat liver　Liao Gangling, Chen jinyan, Ding Lian, et al. Department of Pathology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences & School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, Beijing 100005.

　　【Abstract】　Objective　To study the cellular origin of preneoplastic lesion of liver induced by the 2-acetylaminofluorine (2-AAF) in rat.Methods　 male fisher 344 rats were used for two different carcinogenesis models. Model 1: Rats were fed with regular diet containing 0.02% 2-AAF for totally 28 days, and subjected to a standard two thirds partial hepatectomy (2/3 PH) on the 7th day in order to stimulate the proliferation of oval cells. ³　H thymidine (³H-Tdr) was administered intraperitoneally on the 12th day for selective labelling of oval cells. Model Ⅱ: Rats were subjected to 2/3 PH and ³H-Tdr was administered intraperitoneally 22 hours after the operation for the selective labelling of hepatocytes. The rats were then fed with 2-AAF for totally 28 days after a 9 days recovery period from 2/3 PH. The relationship between preneoplastic lesion and selectively labelled oval cells, or hepatocytes, was traced by autoradiography.Results　 Pathological examination and autoradiography denoted that the silver grains (labelled signals) were only formed in the preneoplastic cells in model I rather than the cells of model II animals.Conlusion　 It is a direct evidence to demonstrate that the preneoplastic cells are mostly originated from the oval cells.

　　【Key words】　Liver neoplasms, experimental　　Precancerous conditions　　Aotoradiography　　Oval cell

　　肝细胞肝癌（HCC）的细胞学起源有两种学说^［1］：一种认为来源于分化成熟的肝细胞，通过去分化过程演变而成；另一种学说认为是由肝内未分化的干细胞或卵圆细胞的异常分化而来的。这两种学说并存而互不相让，关键是迄今尚未获得HCC细胞学起源的直接证据^［2］。我们在以二乙酰胺基芴(2-AAF)为致癌物的大鼠化学致癌模型中，用放射自显影方法追踪癌前细胞与肝细胞或卵圆细胞可能存在的亲子关系，结果提供了癌前细胞来自卵圆细胞的直接证据。

材料与方法

　　1.主要试剂：2-AAF购自Sigma公司；³ H-Tdr购自Amersham公司，37MBq/ml(1mCi=37MBq)，3071 GBq/mmol(1Ci=37GBq)；核4乳胶购自中国原子能研究院物理研究所。

　　2.动物及化学致癌模型：纯种Fisher 344雄性大鼠6只（中国医学科学院实验动物研究所遗传保种室供应）体重180～200 g。模型Ⅰ：大鼠4只，连续饲喂含0.02% 2-AAF的饲料，第7天在乙醚麻醉下作2/3肝大部切除(2/3PH)，第12天末给予

　　³　H-Tdr腹腔注射，以标记卵圆细胞，剂量为37kBq/g体重(1μCi=37kBq)，每8小时1次，共4次，最后一次注射后6小时，麻醉下切下肝右叶作为第一次取材标本（以下简称为MⅠ-1），第28天，断颈处死，取肝脏，作为第2次取材标本（MⅠ-2）。模型Ⅱ：大鼠2只，给以常规饲料，先施行2/3PH，术后22小时给予³H-Tdr腹腔注射，以标记增生的肝细胞，剂量为37kBq/g体重(1 μCi=37kBq)，每8小时1次，共3次，术后第9天开始连续饲喂含0.02% 2-AAF的饲料，在喂2-AAF后的第7天，麻醉后切下肝右叶，作为第一次取材标本（MⅡ-1），喂2-AFF饲料第28天，断颈处死，取肝作为第二次取材标本（MⅡ-2）。

　　3.组织学方法：取材标本中每一肝叶切取一块（厚约0.4 cm）以液氮冷冻，作连续冰冻切片，HE染色或GGT组化染色（Rutenberg AM法，1969年），其余组织全部以Carnoy液固定，石蜡包埋、切片，HE染色。

　　4.放射自显影：脱蜡到水的石蜡切片或经Lillie′s AFF液固定的冰冻切片在暗室涂布核4乳胶，空气干燥1～2小时后收入暗盒，-20℃曝光110天，D19显影3分钟，水洗1分钟，F5定影6～8分钟，流水冲洗15分钟后HE或GGT染色，自显影结果以核内示踪银颗粒数高于本底3倍以上的细胞作为阳性标记细胞，标记百分率表示平均每100个细胞中阳性细胞的百分比；标记强度指平均每个阳性标记细胞核内的银颗粒数。

结果

　　模型Ⅰ：各动物肝脏组织形态无明显差异。MⅠ-1：见卵圆细胞显著增生（见图1），在汇管区尤其是汇管区边周部位形成成堆的卵圆细胞增生区，卵圆细胞的体积约为肝细胞的1/3，圆形或卵圆形，胞浆少，嗜碱性，细胞境界不清，核圆形或卵圆形，着色淡，核膜清晰，可见明显的核仁，增生的卵圆细胞从汇管区穿过界板沿肝窦向小叶内伸入达小叶中带，伸入的卵圆细胞多呈双排或分枝样结构，破坏邻近的肝板，使残存的肝细胞零星夹杂于增生的卵圆细胞之间。组织块连续切片均未见癌前病变。冰冻切片GGT染色见卵圆细胞及胆管上皮细胞呈红色阳性反应，而肝细胞则不着色。石蜡切片自显影可见卵圆细胞核内有密集的银颗粒标记，定位良好，卵圆细胞的标记百分率为96％，被标记核内银颗粒在100个以上，由于过于密集而无法精确记数。而肝细胞内未见标记。此外，62.7％的胆管上皮细胞及18.7%的Kupffer细胞核内也可见标记颗粒（图2）。在冰冻切片自显影GGT复染，见卵圆细胞的自显影标记与GGT阳性着色高度重合（图3）。MⅠ-2染色，见小叶内卵圆细胞进一步增生成片状或条带状区域，并可见多个癌前病灶（增生灶或结节），病灶内细胞排列拥挤紊乱，胞浆嗜碱性增强。癌前病灶的一侧或周边常见有增生的卵圆细胞包绕（图4）。自显影结果显示不仅在卵圆细胞，而且在癌前病灶的细胞核内都有银颗粒标记（图5）：卵圆细胞的标记百分率为83.3%，阳性标记卵圆细胞的平均标记强度为核内41个银颗粒。在癌前病灶中癌前细胞的标记百分率为78.7%，阳性标记癌前细胞的平均标记强度为核内34个银颗粒，个别较大的癌前结节中则很少见有肯定的阳性标记。

　　模型Ⅱ：MⅡ-1（图6）光镜下仅在汇管区出现少量轻度增生的卵圆细胞，小叶内未见卵圆细胞或癌前病变，肝细胞已无明显代偿性增生表现。自显影结果显示96.7%的肝细胞标记阳性，其中40％肝细胞核内银颗粒超过100个以上而无法计数，GGT复染显示胆管上皮及卵圆细胞阳性，但无³H-Tdr标记迹象，而被标记的肝实质细胞均为GGT阴性。MⅡ-2可见卵圆细胞及多个癌前病灶，其形态与MⅠ-2相同。自显影结果表明肝细胞（包括夹杂于增生卵圆细胞之间的肝细胞）³H-Tdr标记程度与MⅡ-1相比未见减弱，而卵圆细胞及癌前病灶的细胞核内均未见被标记迹象，被很强标记的肝细胞与无标记的卵圆细胞及癌前病灶形成明显对比（图7，8）。偶可见癌前病灶的边缘见个别被标记细胞，但它与嗜碱性增强的癌前细胞不同，有丰富的嗜碱性胞浆，显然是被挤压进病灶边缘的肝细胞。

　　图1　标本取自MⅠ-1，见卵圆细胞显著增生，沿肝窦向小叶内伸展　HE×400　图2　 MⅠ-1的放射自显影切片，见卵圆细胞被选择性标记，肝细胞则未被标记，Kupffer细胞核内也可见被标记的银颗粒　HE×200 　图3　 MⅠ-1的放射自显影切片复染GGT，见GGT阳性的卵圆细胞被选择性标记，而GGT阴性的肝细胞未被标记，部分Kupffer细胞亦被标记　×200　图4　标本取自MⅠ-2，放射自显影切片，图中央为一嗜碱性癌前病灶，其左侧可见有卵圆细胞及肝细胞包绕　HE×200 　图5　为图5中长方框所示的局部放大，可见卵圆细胞及嗜碱性癌前病灶细胞的核内有银颗粒标记　HE×800 　图6　标本取自MⅡ-1，放射自显影切片，显示肝细胞标记结果　HE×200　图7　标本取自MⅡ-2，中央见一嗜碱性结节，结节周围有卵圆细胞及肝细胞包绕，肝细胞核内可见强的银颗粒标记，而卵圆细胞及结节内癌前期细胞内则未见标记　自显影＋HE×200　图8　MⅡ-2切片，左下方为一癌前病灶的一部分，周围有增生的卵圆细胞及肝细胞包绕，肝细胞核内可见强的银颗粒标记，而卵圆细胞及结节内癌前细胞核内则未见标记　自显影＋HE×400

讨论

　　2-AAF可引起肝内卵圆细胞增生而抑制肝细胞增生，因此模型Ⅰ动物经2/3PH后，并不引发肝细胞代偿性增生，而是促进了卵圆细胞大量增生，这为³H-Tdr选择性标记卵圆细胞提供了条件。MⅠ-1光镜检查可见有显著的卵圆细胞增生，而无肝细胞增生表现，连续切片观察尚未见癌前病变；自显影结果表明卵圆细胞获得了高百分率、高强度的标记，且与GGT阳性的卵圆细胞在组织切片上高度重合；尽管曝光长达110天，肝细胞核内仍不见标记迹象，表明卵圆细胞获得了满意的选择性标记效果。MⅠ-2在时间上距MI-1已14天，此时不仅有卵圆细胞进一步增生，而且出现了癌前病变。此时因卵圆细胞反复分裂增殖，每个核内的银颗粒数有所减少，但仍有83.3％的卵圆细胞是肯定的阳性标记。癌前病灶周围常有增生的卵圆细胞包绕，提示两者之间的密切关系，而在癌前细胞核内出现明显的定位良好的示踪颗粒则是癌前细胞来自卵圆细胞的直接证据。在模型Ⅱ中，肝大部切除可引起肝细胞迅速发生代偿性增生而并不能引起卵圆细胞增生，此时用³H-Tdr只能使增殖中的肝细胞被标记，而不存在卵圆细胞被标记的可能。MⅡ-1离肝大部切除已16天，距饲喂2-AFF已7天，此时汇管区只有轻度卵圆细胞增生，肝细胞代偿性增生的表现已不明显，也尚无癌前病灶出现。自显影结果表明卵圆细胞未被标记，而肝细胞获得了高百分率、高强度的选择性标记效果。MⅡ-2是2-AAF饲喂28天后的标本，此时已有显著的卵圆细胞增生并已出现癌前病灶。放射自显影见肝细胞的标记程度与MⅡ-1相比并无衰减，这与在两次取材之间肝细胞未见分裂增殖的组织学所见是相符的。在卵圆细胞及癌前病灶细胞的核内都未能找到示踪迹象，无标记的癌前病灶与其周围很强标记的肝细胞形成鲜明对比。以上结果表明它不支持癌前细胞来自肝细胞的可能性；结合模型Ⅰ的结果，从另一角度支持了2-AAF引起的癌前细胞来自卵圆细胞的证据。

　　对HCC的细胞学来源争论不休的重要原因是尚未获得HCC来自肝细胞或卵圆细胞的直接证据。Farber^［3］坚持认为HCC来自肝细胞，而Sell^［2，4］及其支持者根据卵圆细胞的形态、表型特征、癌基因表达以及体外转化等大量间接证据^［5～9］，认为HCC来自卵圆细胞。徐元鼎等^［10］则认为小细胞嗜碱性结节来自卵圆细胞，而嗜酸性结节来自肝细胞。我们用两种动物模型以两个相反相成的角度提供了癌前嗜碱性病灶来自卵圆细胞的直接证据，至于癌前病灶是否也可能来自肝细胞，我们的结果虽不支持但也尚不能排除其可能性。因为我们所用动物数量少，观察的癌前病灶数量毕竟有限。但是我们选用纯种动物作研究对象，而且对每一动物前后两次取材作自身对照观察，最大限度的减少了个体差异，就提供癌前病灶可以来自卵圆细胞的证据而言，依据是充分的。作者并不认为HCC细胞学起源问题已经解决，其一，是本文结果来自我们采用的化学致癌动物模型，可能并不适用于其它化学致癌模型，例如在用二乙基亚硝胺的致癌模型中并无明显卵圆细胞增生过程；其二，本研究仅追踪到卵圆细胞与癌前病灶的关系，而癌前病灶中的绝大多数的结局是改建和消失，其中只有一小部分有可能发展为HCC；其三，本文结果更不能涵盖人类肝癌的细胞学起源，因为人类肝癌的病因比本文动物模型复杂得多。因此，在不同的动物肝脏化学致癌模型中，或选用不同致癌物时，肝癌前细胞是否也可来自卵圆细胞，是值得进一步研究的。

　　本课题为国家自然科学基金资助(基金编号39370292)

参考文献

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　　10　徐元鼎，张昭成，张锦生，等. 3′-Me-DAB 诱发大鼠肝癌的实验病理研究.中华病理学杂志，1988，17：87-89.

(收稿：1997-02-19　　修回：1997-09-12)