脂质体-腺相关病毒质粒复合物介导基因联合抗小鼠肝癌的研究

　　中华微生物学和免疫学杂志2000年第20卷第3期

张景迎　魏道严　陈诗书

　　关键词：小鼠　肝癌　内含子　腺相关病毒　真核质粒表达载体　阳离子脂质体　　目前肝癌主要采用手术、放疗、化疗和局部治疗为主的综合疗法，但治疗效果多不满意，有必要探索新的治疗方法。IL-2和IFN-γ是目前研究较多、疗效较为肯定的2个肿瘤基因治疗用细胞因子基因，并已应用于临床。由于IL-2和IFN-γ在诱导抗瘤免疫反应中的互补性，因此联合应用这两种因子基因可望提高抗瘤效果^〔1〕。我们利用内含子和腺相关病毒调控片段构建了增强的真核质粒表达载体，通过较简单的阳离子脂质体介导转染肝癌细胞，观察了其表达情况、免疫反应及抗瘤效应。

　　材料与方法

　　主要试剂、质粒、细胞株及动物：Dosper、无血清培养基，非同位素杂交试剂盒及β-gal单抗购自Boerhinger公司。Lipofectin及RNA抽提试剂盒为GIBCO BRL公司产品。标准品rIL-2及mIFN-γ为Sigma公司产品。

　　从pC53-SN3切取的CMVp片段替代腺相关病毒质粒pAP中的AP片段后得pAC。分别自pGCEN-hIL-2及pBIuescript SK^+/-mIFN-γ切取hIL-2 cDNA及mIFN-γ cDNA，然后分别插入到pAC中CMVp下游，最后自pAd-CMV-LinkⅠ中切取intron A，插入CMVp与hIL-2或mIFN-γ之间得pAI-hIL-2及pAI-mIFN-γ。小鼠肝癌细胞MM45T.Li由第二军医大学曹广文教授惠赠。CTLL及L929细胞为本室传代保存。BALB/c小鼠，雌性，体重20～22g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。

　　体外细胞转染：24孔板中，每孔种3×10⁴ MM45T.Li细胞，培养24?h后转染。Dosper-DNA复合物制备方法：0.9μg DNA，3.6μl Dosper分别稀释于50μl无血清培养基中，轻混后并两液，混匀后室温置15～45?min即形成复合物。Lipofectin-DNA复合物制备时取0.9μg DNA和1.8μl Lipofectin。无血清培养基洗涤后，加400μl无血清培养基并滴加复合物，培养12?h后去复合物，换成含10%小牛血清的DMEM培养基，继续培养48?h。

　　X-gal及免疫组化染色：转染48?h后，先按常规行X-gal染色，37℃染24?h后再按常规作β-gal免疫组化染色，镜下计数阳性细胞。

　　IL-2及IFN-γ生物活性测定：采用改良MTT法。用IL-2依赖的CTLL测IL-2活性。用L929的细胞毒性试验测IFN-γ活性。

　　Northern印迹分析：用DIG high primer DNA标记试剂盒标记472bp的IL-2 cDNA和465bp的IFN-γ cDNA。30μg RNA经1.1%甲醛变性胶电泳后转移至Hybond尼龙膜上，采用DIG DNA标记系统进行杂交(按说明书操作)。

　　荷瘤小鼠的治疗观察：于每只小鼠左腋皮下注射5×10⁵ MM45T.Li细胞，待肿瘤长至平均直径6.0～6.2mm时进行治疗。随机分4组，每组10只，每只瘤内多点注射100μl脂质体-DNA复合物，内含10μg DNA及40μl Dosper。每隔48?h注射1次。连续注射3次，定期观察肿瘤生长情况。

　　小鼠脾细胞CTL活性：最后1次瘤内注射复合物后14?d取小鼠脾脏，体外制成脾细胞悬液，与⁶⁰Co照射的MM45T.Li细胞共培养5?d，培养液中加50U/ml IL-2，采用5?h ⁵¹　Cr释放法检测CTL对MM45T.Li的杀伤活性。

　　结果及讨论

　　阳离子脂质体介导基因转移具有安全性好、简便易行等优点，但转导效率较低^〔2〕。为提高其效率，需要改进真核质粒表达载体及阳离子脂质体。启动子与治疗基因间插入内含子也可提高基因表达水平^〔3〕，因此，我们用AAV-ITRs和内含子A构建真核质粒表达载体，并通过阳离子脂质体介导转移治疗基因。从实验结果看，Lipofectin和新型阳离子脂质体Dosper均有较好的抵抗血清抑制的作用，且Dosper转染效率明显优于Lipofectin。因此，我们用Dosper介导体内转移IL-2及IFN-γ基因。体外短暂转染MM45T.Li后，48?h取培养上清测IL-2及IFN-γ活性。转染后测得上清IL-2活性48?h为208IU/ml，IFN-γ活性48?h为1?625IU/ml。皮下肝癌模型上，直接瘤内注射Dosper-DNA复合物，最后1次瘤内注射复合物48?h取瘤组织并抽提总RNA。取30μg RNA作Northern分析，分别用IFN-γ探针及IL-2探针可检测到IL-2及IFN-γ表达。与对照组相比，单注射IL-2或IFN-γ基因复合物能抑制肿瘤生长，且IL-2组优于IFN-γ组，联合注射IL-2及IFN-γ基因产生更大的抑制作用。小鼠脾细胞体外与灭活的MM45T.Li共培养后进行CTL活性检测，IL-2基因组高于IFN-γ基因组，联合注射2种基因诱导作用更强(图1)。然而，抑瘤效果持续时间较短，这可能与脂质体转基因表达时间较短有关。说明，应用此治疗方法需要多次治疗才能达到较长期效果。我们还发现，以LacZ作为报告基因，通过X-gal染色及免疫组化评估转染效率，结果显示，免疫组化阳性率明显高于X-gal染色，提示传统的转导表达效率判断方法——X-gal染色，低估了实际转导表达效率，而用β-gal抗体作的免疫组化却能更好地反映转基因效率。其原因是：X-gal染色检测的是表达β-gal生物活性，而活性发挥受许多因素影响，故敏感性差；而用β-gal抗体，则是与β-gal抗原决定簇结合，主要检测表达的β-gal的存在性，故阳性率更高。

　　图1　注射脂质体-DNA复合物后小鼠脾细胞CTL活性

　　Fig 1. Generation of specific splenic CTL activity

　　a. pAC-LacZ; b. pAI-hIL-2; c. pAI-mIFN-γ; d. pAI-hIL-2+pAI-mIFN-γ

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39730440)

　　作者单位：张景迎（上海第二医科大学人类基因治疗研究中心)

　　魏道严（上海第二医科大学人类基因治疗研究中心)

　　陈诗书（上海第二医科大学人类基因治疗研究中心）

　　参考文献

　　1　Rosenthal FM, Cronin K, Bannerji R, et al. Augmentation of antitumor immunity by tumor cells transduced with a retroviral vector carrying the interleukin-2 and interferin-γ cDNAs. Blood, 1994, 83:1289-1298.

　　2　张景迎, 夏爱娣, 陈诗书. 阳离子脂质体用作基因转移载体的研究进展. 国外医学预防、诊断、治疗用生物制品分册, 1997, 20:156-160.

　　3　Vieweg J, Boczkowski D, Roberson KM, et al. Dfficient gene transfer with adeno-associated virus-based plasmids complexed to cationic liposomes for gene therapy of prostate cancer. Cancer Res, 1995, 55:2366-2372.