四种P-糖蛋白在胃癌组织中表达的研究
细胞与分子免疫学杂志 2000年第3期第16卷 肿瘤免疫学
作者：范淼 倪灿荣 曹金龙 蔡清泉
单位：范淼（解放军第455医院病理科，上海200052）；曹金龙（解放军第455医院病理科，上海200052）；蔡清泉（解放军第455医院病理科，上海200052）；倪灿荣（第二军医大学病理学教研室）
关键词：P-糖蛋白；胃癌；免疫组化；催化信号放大系统；p53蛋白
摘要：目的了解术后胃癌的多药耐药性与胃癌组织中P-gp过量表达的关系。方法利用免疫组化方法，以4种抗不同亚型P-gp(C494，MRK16，JSB1和C219)的单克隆抗体(mAb)，以及4种不同抗P-gpmAb的混合抗体和抗p53蛋白mAb，分别检测66例胃癌术后石蜡包埋组织中P-gp和p53的表达(其中16例为冰冻切片)。结果P-gp呈中等或高度表达(占40％～70％)。依次为：C494(75.75％,50/66)，JSB1(62.12％，41/66)，MRK16(48.49％，32/66)和C219(36.36％，24/66)。4种抗P-gpmAb的混合物的阳性检出率为78.79％(52/66)，抗p53蛋白mAb的阳性检出率为60.61％(40/66)。4种抗P-gpmAb的混合物与抗P-gpmAbC494(G=0.90，P∨0.00001)；抗P-gpmAbC494与抗JSB1mAb(G=0.60,P∨0.00005)；抗MRK16mAb与抗C219mAb(G=0.64，P∨0.0001)均高度相关。石蜡和冰冻切片中P-gpC494和JSB1呈中度表达以上者阳性率基本一致；而C219和MRK16的阳性率相差则明显(P∨0.05)。p53蛋白的表达与C494和JSB1的表达相关性显著(P∨0.002和P∨0.002)，与MRK16和C219的表达也有相关性(P∨0.01和P∨0.05)。结论C494阳性表达率最高，可作为胃癌组织中耐药基因检测的标志物。P-gp的过量表达与p53蛋白的表达关系密切。
中图号：R735.2 文献标识码：A 文章编号：1007－8738(2000)03－0264－04
Expression of P- glycoprotein in the gastric carcinoma tissues
using a panel of four mAbs
FAN Miao CAO Jin-long CAI Qing-quan
（Department of Pathology, The 455th Hospital of PLA, Shanghai 200052）
NI Can-rong
（Department of Pathology, The Second Medical University, Shanghai, 2000433, China）
Abstract: Aim To understand relationship between multidrug resistance of post operative gastric cancer and P- gp overexpression in the gastric cancer tissues. Methods Paraffin sections from 66 cases of gastric carcinoma(16 cases of them were frozen sections) were immunohistochemically(IHC) analyzed using a panel of 4 different anti P- glycoprotein monoclonal antibodies (mAbs) composed of C494, MRK16, JSB 1 and C219. Cocktail of the 4 mAbs and mAb against p53 protein were also used. Results Moderate to high levels of P- glycoprotein were detected in 40％ to 70％ of gastric cancer. The positive rate of C494 (75.75％ , 50/66)was higher than those of JSB 1(62.12％ ; 41/66)， MRK16(48.49％ , 32/66)and C219(36.36％ , 24/66). The positive rate of cocktail of the 4 anti P- glycoprotein antibodies was 78.79％ (52/66). The positive rate of p53 protein was 60.61％ (40/66). The positive expression of cocktail of the 4 anti P- glycoproteins was closely related to 4 anti P- gly coprotein C494(G=0.90， P∨ 0.00001)； The positive expression of C494 was closely related to JSB 1(G=0.60,P∨ 0.00005). The positive expression of MRK16 was closely related to C219(G=0.64， P∨ 0.0001). There were similar positive expressions of C494 and JSB 1 between corresponding paraffin and frozen sections, but different ones between C219 and MRK16. Expression of p53 protein was closely related to C494(P∨ 0.002), JSB 1 (P∨ 0.002), MRK16 (P∨ 0.01) and C219 mAbs(P∨ 0.05). Conclusion The positive expression of C494 was the highest and could be as a marker for multidrug resistance gene assay. Overexpression of P- glycoprotein was closely related to p53 protein.
Keywords: P- glycoprotein; gastric cancer; IHC; CSA; p53 protein ▲
胃癌的发病率很高，大多数患者被确诊后已是中晚期，并可远距离转移，复发率高，预后较差；另一方面，因该肿瘤对化疗药物不敏感，疗效仅15％～20％，较其它肿瘤的疗效(40％～70％)低。多柔比星(epidoxorubicin)或鬼臼乙叉甙(etoposide/VP16)是胃癌患者术后常用的化疗药，疗效最高，但最终的治疗效果较差，这可能与天然或继发多药耐药(multidrugresistance,MDR)的产生，P-糖蛋白(P-gp)的过量表达及其它耐药机制的启动有关。
许多研究者〔1，2〕已经在该肿瘤中检测到MDR1mRNA的表达，应用斑点杂交检测的阳性率为41％～80％；而用免疫组化法(immunohistochemicalstaining,IHC)检测P-gp的不同亚型(C219,C494,MRK16和JSB1)的阳性率仅为26％～42％。然而，几种抗P-gpmAb的混合使用，可使P-gp的检出阳性率更准确，其多肽更全面，更能反映出肿瘤组织中P-gp的含量。我们应用4种抗P-gpmAb的 混合物，做催化信号放大系统免疫组化(catalyzedsignalamplificationimmunohistochemicalstaining,CSAIHC)染色，检测了P-gp4个亚型(C494,C219,MRK16和JSB1)在66例胃癌术后石蜡包埋组织切片(其中16例同时采用冰冻切片)中的表达，并与抗P-gp各个亚型的mAb检测的敏感性相比较，观察了P-gp及各个亚型的表达与p53蛋白表达的相关性。
1 材料和方法
1.1材料66例胃癌组织标本为我院1994年～1998年外科手术切除标本。患者术前均未经过化疗。标本经100mL/L中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片分别做HE和IHC染色。其中16例为液氮速冻保存的胃癌标本，临用前解冻后用40mL/L多聚甲醛固定，250g/L蔗糖浸泡24h，8μm厚恒冷箱冰冻切片后，于80℃保存备用。66例胃癌中，男52例，女14例，年龄34～75岁(平均58.75岁)。其中高分化腺癌10例，中等分化腺癌30例，低分化腺癌22例(有2例为印戒细胞癌)，未分化腺癌4例。有淋巴细胞转移者38例，无淋巴细胞转移者28例；有随访结果者36例，其中术后生存时间≥3年者20例(55.55％)，∨3年者16例(6例术后3月内，因肝内或腹膜内转移而死亡)，占44.44％(包括3例未分化腺癌，9例低分化腺癌和4例中等分化腺癌)。P-gp(JSB1)购自武汉博士德公司，P-gp(MRK16)购自迈新公司。P-gp(C494和C219),抗p53(pAb1801)和CSAKit购自丹麦Dako公司。
1.2方法
1.2.1CSAIHC染色石蜡切片脱蜡至水，用0.01mol/LpH7.4PBS洗3次×3min。30mL/LH2O2室温处理20min，同前洗涤。微波抗原修复〔3〕(98℃10min)后，自然冷却，PBS洗3次×3min，依次滴加适当稀释的抗P-gp和抗p53mAb(37℃1h，PBS洗3次×3min)，生物素化马抗鼠IgG(1∶300，37℃30min，PBS洗3次×3min)，第1次HRP标记的链霉亲和素(1∶50037℃30min，PBS洗3次×3min)，酪胺标记的生物素(0.007mmol/L37℃15min，PBS洗3次×3min)及第2次HRP标记的链霉亲和素(1∶1000，37℃30min，PBS洗3次×3min)。如有必要可循环上述步骤数次，以达到信号的最佳放大。最后用0.5g/LDAB＋0.3mL/LH2O2显色(8～10min)，流水洗终止反应，以苏木素衬染后，经洗涤、微波兰化，常规树胶封片。实验中的阳性对照均以CASkit盒内配置的阳性标本片为标准；阴性对照用无关血清或PBS代替抗P-gpmAb和抗p35mAb。
1.2.2结果判断标准和统计学处理〔4〕根据染色反应的深度及阳性细胞的数量分别记为0～3分。染色深度：以多数细胞的呈色反应为标准，黄色者为1分，棕色者为2分，深棕褐色者为3分，不着色者为0分。阳性细胞数：50％为1分，50％～80％为2分，∧80％为3分，无细胞染色者为0分。并根据上述两项指标的积分数分为4级，即：阴性(－)为0分，弱阳性(＋)为1～2分，中等阳性(＋＋)为3～4分，强阳性(＋＋＋)为5～6分。统计学处理采用2检验和t检验。
2 结果
2.1P-gp和p53的分布四种P-gp主要分布于肿瘤细胞的细胞浆内，仅4例核内有C219表达。C494除在胞浆内表达外，在细胞核内也有少量表达。但冰冻切片中，未发现核内表达的病例(图1A～D)。p53全部在肿瘤细胞核内表达(图2)。癌周息肉和正常粘膜上皮P-gp表达在细胞浆内。
2.2各种P-gp在胃癌组织中的表达在66例胃癌中，用4种抗P-gpmAb的混合物检出的阳性率最高(78.79％,52/66);4种抗P-gpmAb单独应用时的检出率依次是：C494为75.76％(50/66),JSB1为62.12％(41/66),MRK16为48.49％(32/66)和C219为36.36％(24/66)。总体上看，中度阳性(＋＋)和高度阳性(＋＋＋)表达占40％～70％。
2.3四种抗P-gpmAb检出的阳性符合率四种抗P-gpmAb的混合物检出P-gp的阳性率与分别应用抗P-gp4个亚型mAb检出C494，JSB1,MRK16和C219的阳性率均高度相关，分别为:
G=0.90，P∨0.00001；G=0.60，P∨0.01；G=
0.64，P∨0.005。
2.4P-gp4个亚型和p53蛋白的表达表2为石蜡和冰冻切片中4个P-gp亚型表达的阳性例数。结果表明，在石蜡和冰冻切片中，P-gpC494和JSB1均呈中等以上强度，分别为：G=1，P∨0.00001和G=0.58，P∨0.01；而C219和MRK16在冰冻切片中的阳性检出率分别为75％和81％；在石蜡切片中的阳性检出率分别为45％和45％，二者相关显著(P∨0.05)。P-gp和p53蛋白的表达见表3和表4。从表4中可以看出，P53的表达与C494和JSB1的表达相关性显著(分别P∨0.001和P∨0.002)；与MRK16和C219的表达也有相关性，分别为P∨0.01和P∨0.05。
图1CSAIHC法检测4种P-gp在胃癌组织中的表达
表1各种P-gp在胃癌组织中的阳性表达
| Region |
Pgp* |
C494 |
MRK16 |
JSB-1 |
C219 |
| - |
+ |
++ |
+++ |
- |
+ |
++ |
+++ |
- |
+ |
++ |
+++ |
- |
+ |
++ |
+++ |
- |
+ |
++ |
+++ |
| Tumour areas |
14 |
12 |
31 |
9 |
16 |
11 |
23 |
16 |
24 |
12 |
14 |
6 |
15 |
9 |
21 |
11 |
42 |
10 |
11 |
3 |
| Transition areas |
46 |
16 |
3 |
1 |
50 |
10 |
6 |
0 |
56 |
8 |
2 |
0 |
51 |
11 |
3 |
1 |
58 |
6 |
2 |
0 |
| Mucosa round |
56 |
8 |
2 |
0 |
59 |
6 |
1 |
0 |
62 |
4 |
0 |
0 |
60 |
5 |
1 |
0 |
65 |
1 |
0 |
0 |
| tumour tissue |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
图2p53在胃癌组织中的表达(CSAIHC,×132)
表2冰冻和石蜡切片中4种P-gp亚型的表达
| Expression intensity |
C94 |
JSB-1 |
C219 |
MRK16 |
| PRF |
FZ |
PRF |
FZ |
PRF |
FZ |
PRF |
FZ |
| - |
3 |
2 |
5 |
4 |
9 |
4 |
7 |
3 |
| + |
1 |
2 |
2 |
2 |
1 |
2 |
1 |
2 |
| ++ |
8 |
5 |
4 |
8 |
4 |
6 |
3 |
6 |
| +++ |
4 |
7 |
5 |
2 |
2 |
4 |
3 |
5 |
表366例胃癌组织中P-gp和p35蛋白的表达
|
Antibody used |
Postitive cases(%) |
Negative cases(%) |
| AntiC494mAb |
50(75.76) |
16(24.24) |
| AntiJSB1mAb |
41(62.12) |
25(37.88) |
| AntiC219mAb |
24(36.36) |
42(63.63) |
| AntiMRK16mAb |
32(48.49) |
34(51.51) |
| Antip53mAb |
46(69.69) |
20(30.30) |
表466例胃癌组织中P-gp与p35蛋白表达的相关性
| |
|
|
| AntiC494/p53mAb |
42/46(91.3)a |
8/20(40) |
| AntiJSB1/p53mAb |
36/46(78.26)a |
5/20(25) |
| AntiMRK16/p53mAb |
28/46(60.86)b |
4/20(20) |
| AntiC219/p53mAb |
22/46(47.82)b |
2/20(10) |
3 讨论
大多数研究结果显示，P-gp蛋白在胃癌组织中的表达阳性率很低，其中C219，MRK16和JSB1的表达率分别为26％，42％和40％〔5，6〕。本研究中，P-gp表达的阳性率高于文献报道，这可能与IHC染色过程中采用微波抗原修复和敏感的CSAIHC法有关。Tomonage等〔8〕表明，胃癌组织中MDR1的表达仅20％，而多药耐药基因相关蛋白(MRP)的表达则很高。体外培养的细胞无MDR1的表达，提示胃癌组织中MDR1是否表达对癌细胞的耐药性无直接的相关性，可能还存在其它的耐药机制。但本文的结果显示，C494的表达阳性率达75.76％，与Lacueva等〔8〕的研究结果较为一致，提示胃癌组织和其它肿瘤组织类似，MDR1起主要作用。
P-gp在石蜡切片和冰冻切片中的阳性率基本一致，因此，石蜡切片完全可以作为MDR1的检测标本，尤其是对C494的检测更为理想。MRK16在石蜡切片中的表达较冰冻切片中低。
P-gp的表达与突变型p53蛋白的累积之间的相关性存在较大差异。在乳腺癌中，P-gp和p53的表达密切相关，而在妇产科肿瘤和B细胞慢性淋巴细胞白血病中则无相关性。Oka等〔11〕对40例结肠癌的研究发现，p53和P-gp的共同表达关系密切。本研究在66例胃癌组织中，P-gp4个亚型的阳性表达均与p53的表达关系密切。MDR1基因表达受多种因素的影响。重金属、生长因子及活化的癌基因等，均可通过活化磷酯酶C而使MDR1启动子的活性增加。突变型p53功能的丧失可引起基因组不稳定，这种内在特性可能就是MDR1在高度恶性细胞内扩增，最终表现为MDR的原因，人们已在结肠癌、乳腺癌及胃癌中得到证实。■Fig 1 Expressions of 4 P- glycoproteins in gastric cancer tissues by CSA IHC A: Expression of MRK16(× 66); B: Expression of C494(× 330)； C： Expression of JSB 1(× 330); D: Expression of C219(× 132).
Fig 2 Expression of p53 protein in gastric cancer tissues (CSA IHC, × 132)
Tab 1 Positive cases of 4 P- gp expressions in the 66 cases ofgastric cancer tissues (n=66) Pgp C494 MRK16 JSB 1 C219 Region
Tab 2 Positive cases of 4 P- gp expressions in frozen(Fz)tissues and paraffin (PRF) embedded tissues (n=16) Expression C494 JSB 1 C219 MRK16 intensity PRF FZ PRF FZ PRF FZ PRF FZ
Tab 3 Positive rates of P- gp and p53 protein expressions in the 66 cases of gastric cancer tissues Antibody used Positive cases(％ ) Negative cases(％ )
Tab 4 Correlation between P- gp and p53 protein expressions in the 66 cases of gastric cancer tissues ─ ─ Antibody used ＋ /＋ (％ ) ＋ /－ (％ )
a: The p53 expression was highly consistent with C494 and JSB 1 ex presions (P∨ 0.01 and P∨ 0.002, respectively);b: The p53 expression was significantly correlated with the MRK16 and C219 expressions(P∨ 0.01 and P∨ 0.05, respectively).
作者简介：范淼，女，37岁，技师上海市淮海西路338号， Tel.(021)62800157
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收稿日期：1999－08－03
修回日期：1999－12－21
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