人胎盘型谷胱甘肽S转移酶在胃癌组织中的表达与基因甲基化关系的研究^＊

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第5期

梁晓秋　苏琦　杨和平　朱建思　周建国　李一琴

　　摘　要　目的：研究胃癌组织中GST－π的表达与其基因甲基化状态的关系。方法：应用S－P法检测116例胃癌和53例胃癌前病变的GST－π表达和限制性内切酶及PCR、Southern印迹方法检测14例胃癌及其相应正常胃粘膜GST－πDNA5′端调控区CCGG特定位点的甲基化水平。结果：GST－π阳性率，正常胃粘膜10％(4/39)，胃癌77％(89/116)，肠上皮化生76％(19/25)，不典型增生89％(25/28)。GST－π在胃癌及癌前病变中的表达较正常胃粘膜增高(P＜0.01)。胃癌组织中GST－π基因较正常胃粘膜呈现高度去甲基化（P＜0.01），胃癌GST－π基因5′端调控区低甲基化与其GST－π表达增加呈相关性（P＜0.05）。结论：GST－π在胃癌及癌前病变中的表达与胃癌的发生发展密切相关，GST－π可作为胃癌的肿瘤相关抗原；GST－π基因5′端调控区低甲基化可能是GST－π高表达的分子机理。

　　关键词：胃肿瘤GST－π单克隆抗体基因免疫组织化学DNA甲基化

　　胎盘型谷胱甘肽S转移酶（glutathione S transferase π,GST－π）在许多人体组织及癌前病变中有异常表达，且患者血清中的含量亦高于正常人，尤其是消化道肿瘤^[1,2]。在胃癌及癌前病变组织中的高表达也许与胃癌的发生发展有关^[3]。就其表达增高的分子机理而言，认为是基因的转录水平提高所致，与GST－πm RNA水平升高一致，而没有基因的扩增、突变^[4]。DNA甲基化对基因表达的调控作用已得到证实，肿瘤细胞中某些异常表达的基因常表现为低甲基化状态^[5]。本文旨在研究人胃癌组织中GST－π的表达与基因5′端调控区CCGG位点甲基化程度之间的关系，探讨GST－π表达增加的分子机理。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本收集与处理

　　标本来源于衡阳医学院附属第一医院肿瘤外科1994年5月～1995年9月胃癌手术切除标本，以患者自身的癌远端正常组织作为正常对照，共14例。其中男12例，女2例，年龄27～72岁。全部病例均经病理证实，其中高分化腺癌3例，低分化腺癌10例，未分化癌1例。标本离体后，立即取材，－70℃贮存。另收集病理教研室存档的胃癌石蜡标本102例，肠上皮化生25例，不典型增生28例，正常胃粘膜39例。

　　1.2　S－P法免疫组织化学检查

　　操作步骤为1)石蜡切片脱蜡、水化；2)加试剂A封闭10min；3)加试剂B孵育10min；4)第一抗体孵育，4℃，过夜，PBS液洗；5)分别加试剂C、D各孵育10min，PBS液洗；6)DAB显色、复染、封片。GST－π单抗由军事医学科学院基础研究所免疫室提供，稀释度为1:800～1200。同时以PBS置换一抗作空白对照，已知阳性切片作阳性对照。判断标准：反应物定位清晰，细胞浆内或胞膜有棕黄色颗粒为阳性，不着色为阴性。

　　1.3　DNA甲基化检测

　　按文献^[6]方法加以改良。操作步骤为1)组织DNA的提取、用紫外分光光度仪测所提取DNA的A260/A280，测定纯度；2)分别以HpaⅡ、MspⅠDNA限制性内切酶酶切；3)PCR扩增；将酶切后DNA加入引物和dATP、dTTP、dUTP、TaqDNA酶·[α-³²P]dCTP，循环参数为95℃，60s，55℃，50s，72℃，30s，30个循环后72℃延伸7min；4)电泳、Southern印迹转膜、放射自显影。GST－π引物由本院分子生物学实验中心合成，引物根据文献设计[4]，为GST－π基因5′端调控序列片段，扩增长度为327bp(nt位置－291至＋36)，引物Ⅰ5′－AG TTCG CTGCGCACACTTCG－3′(－291至－272)，引物Ⅱ5′－ACTCACTGGTGGCGAAGACT－3′(＋17至＋36)。

　　2　结果

　　2.1　GST－π在胃癌、癌前病变及正常胃粘膜组织中的表达

　　39例正常胃粘膜中，90％GST－π呈阴性；116例胃癌病例中，总阳性率为77％，高于正常胃粘膜，统计学上差异有显著性(P＜0.01)。胃粘膜肠上皮化生与不典型增生阳性率各为76％、89％，也高于正常胃粘膜(P＜0.01)，见表1。

表1　胃癌及癌前病变GST－π的表达

＊P＜0.01

　　2.2　GST－π基因甲基化分析

　　用限制性核酸内切酶MspⅠ和HpaⅡ分析GST－πDNA5′端调控区甲基化水平。MspⅠ能切割CCGG和CmeCGG，而HpaⅡ只能切割CCGG，不能切割CmeCGG序列，附图显示了本研究所检测的GST－π5′端调控区的CCGG位点。

附图　GST－π基因5′端调控区CCGG限制性酶酶切图谱及引物扩增片段

　　当CCGG位点全部呈甲基化状态时，此模板DNA经HpaⅡ酶切后仍可扩增出一条327bp条带。如果任何一个CCGG位点出现了去甲基化，将无法扩增出327bp条带，或者因单向PCR而出现放射强度很弱的短于327bp的条带。胃癌及正常胃粘膜GST－π基因甲基化检测结果见表2。胃癌中GST－π基因甲基化程度低于正常胃粘膜组织（P＜0.01）。

表2　胃癌与正常胃粘膜GST－π基因甲基化程度比较

＊P＜0.01

　　GST－π基因5′端调控区CCGG位点的甲基化程度及表达产物相关性分析（表3），发现GST－π基因5′端调控区CCGG位点的甲基化程度与GST－π表达有相关性，其GST－π基因5′端调控区呈低甲基化的GST－π表达，阳性率高于呈甲基化状态。

表3　GST－π基因甲基化程度与GST－π表达相关性分析

P＜0.05

　　3　讨论

　　GSTs广泛分布于哺乳类动物各组织中，而GST－π主要分布于胎盘中^[7]。GST－π在胃癌组织中的阳性率达77％，在癌前病变，即不典型增生与肠上皮化生中阳性率分别为89％、76％，均高于正常胃粘膜，与文献报道一致^[3,8]。GST－π在胃癌癌变的早期阶段以及各组织类型胃癌中的表达明显增高，有可能是一种上皮细胞分化发育相关抗原，影响细胞的癌变过程。可作为胃癌的癌相关抗原。

　　胃癌组织中GST－π基因5′端调控序列的甲基化程度与蛋白表达的关系。本研究发现，胃癌组织GST－π基因5′端调控区CCGG位点与相应正常胃粘膜比较呈明显的低甲基化，并且基因的低甲基化与GST－π表达增高一致。DNA甲基化主要指胞嘧啶(C)5－位碳位上的甲基化，它是一种DNA复制后的酶促反应过程。基因某一特定位点，尤其是靠近5′端调控序列的去甲基化可使基因的转录活性增加，在组织中不表达的基因多呈高甲基化^[9]。在人肝癌、膀胱癌以及淋巴瘤等肿瘤组织中，发现C－Ha·ras、C－myc、C－mos、AFP和EGF等癌基因和癌相关基因低甲基化，而相对正常组织却无这种现象^[10～12]。雌激素受体（ER）基因5′端调控区低甲基化与其在乳腺癌组织中高表达有关，ER阳性的乳腺癌与ER阴性的相比，基因5′端调控区呈明显的低甲基化^[13]。基因甲基化状态影响基因表达。基因5′端调控区序列的甲基化改变了DNA的构型，转录因子不能与调控区的DNA序列相结合或甲基化了的序列与细胞内甲基化的CpG结合蛋白结合，从而阻止了该序列与转录因子的结合^[14]。相反，基因低甲基化则为基因的表达创造了必要的结构基础，是基因表达的必须条件。与细胞生长分化有密切关系的癌基因和抗癌基因及癌相关基因同样受甲基化的调节，在癌组织中癌基因及癌相关基因的表达促进肿瘤的发生发展，DNA低甲基化可使它们重新开放或在特定组织中异常表达，促进细胞恶性转化，导致肿瘤代谢异常以及出现其它复杂的生物学特征^[15]。本研究的结果提示胃癌组织中GST－π基因5′端调控区的低甲基化对GST－π的高表达起一定的作用。

　　＊本文课题受湖南省卫生厅科研基金“8.5”重点项目资助(编号9310)

　　作者单位：衡阳医学院肿瘤研究所（湖南省衡阳市421001）

　　参考文献

　　1　 Tsuchida S,Sekine Y,Shineha R,et al.Elevation of placental glutathione S transferase form(GST－ π ) in tumor tissues and levels in sera of patients with cancer.Cancer Res,1989;49(18):5225

　　2　 Niitsu Y,Takahashi Y,Saito T,et al.Serum glutathione S transferase－ π as a tumor marker for gastrointestinal malignancies.Cancer,1989;63:317

　　3　 齐春会，郭山春，李华，等.人胎盘型谷胱甘肽S－转移酶在胃癌及癌前病变组织中的表达.中华病理学杂志，1995;24(1):53～ 4

　　4　 Moffat GJ,Mclaren AW, Wolf CR. Involvement of Jun and Fos proteins in regulating transcriptional activation of human Pi class glutathiones S－ transferase gene in multidrug－ resistant MCF7 breast cancer cells. J Biol Chem,1994;269:16397

　　5　 Bird A.The essentials of DNA methylation.Cell,1992;70:5

　　6　 范钰，沈岩，傅四东，等.快速检测DNA甲基化的新方法.生物化学与生物物理进展,1993;20:458～ 9

　　7　 Hendrich S, Pitot HC. Enzymes of glutathione metabolism as biochemical markers during hepatocarcinogenesis.Cancer Metastasis Rev,1987;6:155

　　8　 尹宗柱，崔城洛，张良和，等.人胎盘GST－π抗体的免疫组织化学检测对胃癌和胃癌前期病变的早期诊断意义.中华肿瘤杂志，1989;11(2):114～ 5

　　9　 肖文华.癌基因及癌相关基因的甲基化研究进展.国外医学分子生物学分册，1993;(4):224～ 427

　　10　 Senno LD,Maestri I,Piva R,et al.Differential hypomethylation of the c－ myc protooncogene in bladder cancers at different stages and grades. J Urol,1989;142:146

　　11　 Rao PM,Antony A,Rajalakshmi S,et al.Studies on hypomethylation of liver DNA during early stage of chemical carcinogenesis in rat liver. Carcinogenesis,1989;10:933

　　12　 Mass MJ,Schorchinsky NS,Lasley JA,et al. Consistant oncogene methylation changes in epithelial cells chemically tranformed in vitro. Biochem Biophys Res Commun,1989;164:693

　　13　 Piva R,Hanau S,Maestri I,et al.Different methylation of oestrogen receptor DNA in human breast carcinomas with and without oestrogen receptor.Br J Cancer,1990;61:270

　　14　 Coni P,Pang J,Pichiri G,et al.Hypomethylation of β － hydrohy－ β － methylglutary1 coenzyme A reductase gene and its expression during hepatocarcinogenesis in the rat.Carcinogenesis,1992;13:497

　　15　 Goelz SE,Vogelstein B,Hamilton SR,et al. Hypomethylation of DNA from benign and malignant human colon neoplasms.Science,1985;228:187