组织蛋白酶B在胃癌组织中表达及其意义

　　第二军医大学学报2000年第21卷第4期

吴平平　余红仙　江悦琴　姜叙诚　王瑞年

　　摘　要　目的：探讨组织蛋白酶B（CB）在胃癌中的表达以及与胃癌浸润的关系。方法：用免疫组织化学SP法对38例胃癌组织中组织蛋白酶B的表达进行检测。结果：CB有较强阳性表达的胃癌在分化型和差分化型之间没有显著差异；进展期癌的表达显著高于早期癌；68.4%的胃癌标本中肿瘤间质的成纤维细胞和血管内皮细胞呈CB阳性反应。结论：CB的表达增高与胃癌的浸润有密切关系，血管内皮细胞表达CB增多可能是促进肿瘤浸润生长的机制之一。

　　关键词：胃肿瘤；免疫组织化学；组织蛋白酶B

　　癌细胞侵入基底膜的过程包括三个步骤：粘附、蛋白溶解和移动^［1］。内源性蛋白溶解酶参与了蛋白溶解的过程。已知组织蛋白酶B(CB)能降解层粘蛋白等细胞外基质成分，有利于肿瘤的浸润^［2］。已有研究表明组织蛋白酶B在肝细胞癌^［3］、肺癌、结肠癌^［4］等恶性肿瘤中表达增强并与浸润有关。本文用免疫组化方法对各种类型的胃癌标本进行检测，探讨组织蛋白酶B在胃癌中的表达以及与胃癌浸润的关系。

　　1　材料和方法

　　1.1　胃癌标本　38例胃癌手术标本为上海第二医科大学病理学教研室存档标本。其中男性25例，平均年龄59岁；女性13例，平均年龄62岁。标本均经10%甲醛溶液固定、石蜡包埋，作5μm厚的切片。

　　1.2　分组　每一标本的石蜡切片作常规HE染色，进行组织学分型。按癌的浸润深度分成早期癌和进展期癌组；按分化程度分成分化型癌和差分化型癌组。

　　1.3　免疫组化　采用SP法（链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）：石蜡切片常规脱蜡至水，0.3％H₂O₂/甲醇液去除内源性过氧化物酶，正常血清封闭，1∶2000的兔抗人肝组织蛋白酶B（由仁济医院消化所提供）作为一抗，滴加后4℃过夜，次日加羊抗兔的IgG作为二抗，作用60 min，SP30 min，DAB显色，苏木精复染。对照片免去一抗，其它步骤相同。

　　1.4　免疫组化分析　组织细胞中的组织蛋白酶B阳性反应从两方面分析：一是肿瘤细胞的阳性率，当30%的肿瘤细胞染色阳性为1+，30%～60%为2+，＞60%为3+； 二是染色强度，阴性为0，染色从弱、中到强分别为1+，2+和3+。以上两者相加，大于3+者为有较强的阳性反应^［5］。

　　1.5　统计学处理　采用χ²检验。

　　2　结　果

　　CB阳性表现为细胞质着成棕色，胃癌细胞中这种棕色较深，可呈颗粒状(图1A)，或均匀分布于胞质内（图1B），胞核和胞膜均呈阴性。管状腺癌与粘液细胞癌的CB较强阳性表达无明显的区别。紧靠癌旁的胃粘膜染色较深，远离癌旁的较浅，多数呈颗粒状。对照片阴性。(1)38例人胃癌手术标本，其中早期癌6例，进展期癌32例。经H-E染片观察，分化型癌（包括管状腺癌、乳头状腺癌、粘液腺癌）17例，差分化型癌（主要包括低分化、未分化癌和印戒细胞癌）有21例。分化型癌中CB呈较强表达10例，占58.8%；差分化型癌中8例，占38.1%。两者在统计学上无显著差异。进展期癌中有62.5%（20/32）的病例CB呈较强阳性表达，而在早期癌仅有16.7%(1/6）。进展期癌CB较强阳性表达显著高于早期癌(P＜0.01)。(2)另外，我们还观察到68.4%（26/38例）的胃癌组织间质内部分成纤维细胞和血管内皮细胞呈CB表达阳性，但其染色强度较弱（图2A，B）。癌旁粘膜有68.4%（26/38例）CB表达阳性，但间质内的成纤维细胞和血管内皮细胞很少见到 cB表达阳性。

图 1　胃癌细胞内的CB阳性

　　fig 1　The positive expression of CB in the cells of

　　gastric carcinoma.(×400)

图 2　胃癌间质内成纤维细胞(A)和血管内皮细胞(B)的CB表达阳性

　　fig 2　 The positive expression of CB is shown in fibroblasts (A) and

　　vascular endotheliocy (B) of gastric carcinoma interstitum.(×200)

　　3　讨　论

　　胃癌的组织类型较为复杂，往往在同一病例中可有几种类型的成分同时存在，如果把组织类型归为分化型和差分化型两大类，就可将CB的表达与胃癌的分化程度简单地联系起来。Plebani等^［6］曾发现差或中等度分化的胃癌中CB的表达比高分化胃癌强，而本实验结果发现CB的表达在胃癌的分化型和差分化型之间没有显著差异。因此CB的表达与胃癌的分化程度之间是否有必然的联系尚待进一步证实。

　　CB是一种溶酶体内巯基蛋白酶，释放后可进入到细胞外并降解层粘蛋白,在肿瘤突破基底膜过程中起重要作用。肿瘤细胞合成、分泌CB增多有利于降解细胞外基质，促进肿瘤细胞向深部组织浸润。判断早期和进展期胃癌主要根据癌组织的浸润深度。本实验发现进展期胃癌CB的表达显著高于早期癌，因此CB表达的增高提示了胃癌易向深部浸润的倾向。Hirai等在结肠癌中用原位杂交方法发现CB表达信号在A与D期（Duke法）中有两个高峰，说明CB在人结肠癌早期浸润与远处转移中起重要作用。Kusunoki在甲状腺肿瘤中发现包膜有浸润者比没有浸润者CB表达显著增高^［7］。以上这些均说明CB的增高与肿瘤浸润有密切关系。Khan等^［8］对胃癌组织作了CB表达与肿瘤相关层粘蛋白表达之间相关性研究，发现凡CB表达强阳性的胃癌组织中层粘蛋白的分布均呈碎片状，进一步证实CB表达增强可导致层粘蛋白的降解，促进胃癌组织的浸润。 cB在释放前存在于溶酶体内，因此免疫组化中形态呈颗粒状。然而本实验观察到在肿瘤细胞内CB除呈颗粒状外，还呈弥散性，这种现象有人推测可能是肿瘤细胞胞质中存在着特异的CB，或由于肿瘤细胞中信号肽的缺失，使CB不能进入溶酶体而弥散入胞质，从而造成分布的改变。癌旁粘膜中CB表达虽呈阳性，但以颗粒状为主，而且越接近癌组织阳性程度越高。这一现象说明癌旁粘膜对癌的浸润可能也起一定作用。

　　有实验表明肿瘤在浸润性生长时血管生长因子的表达增高，所以浸润时首先有血管形成，然后肿瘤逐渐长大并向周围扩散。这一现象已在胃癌组织中得到了证实^［9］。本实验发现在胃癌组织间质中，成纤维细胞和血管内皮细胞CB呈阳性表达，这是否说明内皮细胞中CB的合成和分泌增多，促进基质降解而有利于血管生长呢？这尚需作进一步的研究。

　　参考文献

　　［1］Liotta LA.Tumor invasion and metastases:role of extracellular matrix.Rhoads memorial award lecture［J］.Cancer res,1986,46（1）:1-7.

　　［2］Buck MR,Karustis DG,Day NA,et al.Degradation of extracellular-matrix proteins by human cathepsin B from normal and tumoral tissues［J］.Biochem j,1992,282(2):273-278.

　　［3］Terada T,Ohta T,Minato H,et al:Expression of pancreatic trypsinogen/trypsin and cathepsin B in human cholangiocarcinoma and hepatocellular carcinomas［J］.Hum pathol,1995,26(7):746-752.

　　［4］Hirai K,Yokoyama M,Asano G,et al:Expression of cathepsin B and cystatin C in human colorectal cancer［J］.Hum Pathol,1999,30(6):680-686.

　　［5］Strojinik T,Kos J,Zidanik B,et al.Cathepsin B immunohistochemical staining in tumor and endothelial cells is a new prognostic factor for survival in patients with brain tumors［J］.Clin.Cancer Res,1999,5(3):559-567.

　　［6］Plebani M,Herszyi L,Cardin R,et al.Cystein and serine proteases in gastric cancer［J］.Cancer,1995,76(3):367-375.

　　［7］Kusunoki T,Nishida S,Nakano T,et al.Study on cathepsin B activity in human thyroid tumors［J］.Auris Nasus Larynx,1995,22(1):43-48.

　　［8］Khan A,Krishna M,Baker SP,et al.Cathepsin B expression and its correlation with tumor-associated laminin and tumor progression in gastric cancer［J］.Arch pathol Lab Med，1998,122(2):172-177.