L-缬氨酸缺乏对大鼠胃癌生长及免疫状态的影响
肠外与肠内营养 2000年第1期第7卷 论著
作者：季峰 朱秋红 王群燕 厉有名 黄怀德
单位：浙江大学医学院附属第一医院，杭州 310003
关键词：L-缬氨酸；缺乏；胃癌生长；蛋白合成；免疫状态
摘 要：目的：探索L-缬氨酸(L-Val)缺乏对大鼠胃癌与对照肌组织及体外培养胃癌细胞与成纤维细胞蛋白合成与免疫状态的影响。 方法：用［1-13C］Leu示踪标记的“液闪法”测定大鼠胃癌与肌组织蛋白质合成率、用3H-Leu掺入法测定体外培养胃癌细胞与成纤维细胞蛋白质合成。 结果：14只大鼠胃癌组织经无L-Val输液组(L-Val deprivated solution,DS)作用后蛋白合成率显著低于L-Val平衡输液组(L-Val balanced solution,BS n=10)，P＜0.01；对照肌组织经BS、DS作用后蛋白合成率差异不显著。MKN45胃癌细胞株BS组蛋白合成率显著高于DS组(P＜0.05)，NIH3T3成纤维细胞株这两组蛋白合成差异不显著。DS作用过的负胃癌大鼠血清白蛋白、转铁蛋白、前白蛋白及C3含量与BS组比较差异不显著。 结论：配制一种既阻碍癌肿生长，又不引发宿主负氮平衡和免疫力下降的无L-Val的氨基酸输液治疗胃癌可能有很大的临床应用价值。
中图分类号：R459.3 文献标识码： A
文章编号：1007-810X(2000)01-0045-03
Effects of L-valine depriving on the growth of gastric cancer
in rats and rats immune condition
JI Feng
(First Affiliated Hospital of Zhejiang Medical University,Hangzhou 310003,China)
ZHU Qiu-hong
(First Affiliated Hospital of Zhejiang Medical University,Hangzhou 310003,China)
WANG Qun-yan et al
(First Affiliated Hospital of Zhejiang Medical University,Hangzhou 310003,China)
Abstract：Objectives:To study the effects of L-valine(L-Val) depriving on the growth of gastric cancer in rats and rats’s immune condition. Methods:［1-13C］ Leu labeling "Flooding Method"，3H-Leu incorporation and biochemical analysis were used to examine the protein synthesis of gastric cancer and normal muscle tissues in rats and rats serum immune proteins respectively. Results:The rate of protein synthesis in gastric cancer tissues of 14 rats given by L-Val deprivated solution(DS) was significantly lower than that of 10 rats given by L-Val balanced solution(BS),P＜0.01.There was no change in rate of protein synthesis of normal muscle tissue in rats between BS and DS.The rate of protein synthesis of MKN45 gastric cancer cell cultured in BS medium was signifcantly higher than that of the cancer cell cultured in DS medium(P＜0.05).No difference of the rate of protein synthesis was discovered in NIH3T3 fibroblast cell between BS and DS cutures.There were no differences of levels of serum albumin,prealbumin,transferin and C3 in rats between DS and BS. Conclusions:It would be possible to discover a L-Val imbalanced amino acid solution which might inhibit the growth of gastric cancer without producing negative nitrogen balance and worsing immune ability of host in clinical practise.
Key words：L-Valine; Depriving; Growth of gastric cancer; Protein synthesis; Immune condition▲
0 引言
L-缬氨酸(L-Val)是必需氨基酸及支链氨基酸的一种。胃癌组织因快速生长的需要，对L-Val摄取及消耗明显增加。在以往工作中，我们于人体非离体胃癌组织中证实摄取L-Val的能力明显高于正常组织［1］；减少或去除L-Val，可阻碍培养的胃癌细胞增殖和提高胃癌细胞对某些化疗药物的敏感性，但对一些正常非癌细胞的生长却影响不大［2，3］，提示L-Val可能是影响胃癌生长的一种限制性氨基酸。本研究采用［1-13C］Leu示踪标记的“液闪法”、3H-Leu掺入法及生化分析，分别观察L-Val缺乏对胃癌与对照肌组织及培养的胃癌细胞蛋白合成与免疫状态的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组与输液的组成及方法 30只雄性Wistar大鼠，用N-甲基-N-亚硝基-N-硝基胍(MNNG)诱发胃癌。均经病理证实形成直径＞0.6 cm的胃癌。大鼠随机分成三组，其中无L-Val输液组(L-Val deprivated salution,DS)14只,L-Val平衡输液组(L-Val balanced salution,BS)10只，无氨基酸(用5% GNS)输液对照组6只。DS及BS由日本东北大学医学部第二外科配制提供，规格为250 ml/瓶，DS除无L-Val外，其余成分同BS。BS中L-Val浓度为14 mg/L(表1)。
表1 氨基酸输液的组成(g/L)
Table 1 Composition of amino acid solutions(g/L)
| 氨基酸 |
DS |
BS |
| L-异亮氨酸 |
1.2 |
1.2 |
| L-亮氨酸 |
2.3 |
2.3 |
| L-赖氨酸 |
1.6 |
1.6 |
| L-苯丙氨酸 |
1.9 |
1.9 |
| L-蛋氨酸 |
0.8 |
0.8 |
| L-苏氨酸 |
1.0 |
1.0 |
| L-色氨酸 |
0.4 |
0.4 |
| L-缬氨酸 |
0 |
1.4 |
| 甘氨酸 |
3.1 |
3.1 |
| L-精氨酸 |
2.5 |
2.5 |
| L-组氨酸 |
1.0 |
1.0 |
| L-丙氨酸 |
1.6 |
1.6 |
| L-天冬氨酸 |
0.4 |
0.4 |
| L-谷氨酸 |
0.2 |
0.2 |
| L-脯氨酸 |
2.1 |
2.1 |
| L-丝氨酸 |
1.0 |
1.0 |
| L-酪氨酸 |
0.1 |
0.1 |
| 总氨基酸 |
21.2 |
22.6 |
所有大鼠用戊巴比妥腹腔麻醉后经颈内静脉插管，禁食期间，三组大鼠分别用BS(250 ml/d),DS(250 ml/d)及5% GNS 250 ml/d输液，连续2天。
1.2 标本采取 处死前90 min，所有大鼠均静脉内注射［1-13C］Leu(由0.25 g［1-13C］Leu及4.75 g Leu组成的混合物，Trace technologies,Somerville,MA,美国)5 g/kg。断颈采血5～10 ml，离析血清，待测血清蛋白、C3及供癌细胞等培养用，同时将胃癌切除标本及取出少许切口皮下肌组织(50～100 mg)，迅速用冷等渗盐水冲洗，沥干后，迅速贮存于液氮中，备用。
1.3 ［1-13C］Leu示踪标记“液闪法”测定蛋白合成 具体方法详见文献［4］，胃癌及肌组织经冷盐酸乙醇中匀浆器磨碎，以过氯酸冲洗及碱化等分离出蛋白，风干蛋白，再碱化并于盐酸中分解，用离子交换层析法分离出Leu产物，Rank-Hilger色差仪测定Leu浓度，气同位素比质谱仪测定含3 μmol Leu中Leu羟基团的13C O2释放量，结果按下式计算：
δ13C‰=(R样本-R标准)×1 000/R标准(R为13C∶12C；标准为1.111 232 8原子数‰)再用自动分析仪测出蛋白合成率(%)。
1.4 培养细胞3H-Leu掺入法测定蛋白合成 培养细胞为人胃低分化腺癌MKN45(上海消化病研究所提供)及成纤维细胞NIH3T3(浙江中医学院分子生物中心提供)。两种细胞均培养在恒温37℃、5%CO2和95%空气的培养箱中，所有培养基为L-Val的MEM培养基(sigma)，分别用BS、DS及GNS处理过的大鼠血清配制成完全培养基。各种培养液均含有100 u/ml青霉素及100 μg/ml链霉素。细胞培养4天后，采用3H-Leu掺入法测定蛋白合成率，Backmen LS 3801型液闪仪测定各样本的CPM。用日立7170型自动生化分析仪测定血清白蛋白、转铁蛋白及前白蛋白，ARRAY-360测定C3含量。
1.5 统计分析 采用t检验。
2 结果
2.1 大鼠胃癌及肌组织蛋白的合成率 胃癌组织经BS、DS及GNS作用后蛋白合成率(%)分别为(2.45±0.32)、(1.83±0.21)及(1.72±0.23)，三组相比差异显著(P均＜0.01)，DS与GNS组相比差异不显著。对照肌组织经BS、DS及GNS作用的蛋白合成率(%)分别为(1.75±0.23)、(1.67±0.29)及(1.76±0.18)，三组间差异不显著。
2.2 培养细胞蛋白合成(表2) MKN45胃癌细胞株BS组蛋白合成与DS及GNS组比较有显著性差异(P＜0.05)，NIH3T3成纤维细胞株BS组蛋白合成与DS及GNS组比较无显著性差异。两株细胞蛋白合成DS与GNS组比较，均无显著性差异。
表2 3H-Leu掺入法测定培养细胞蛋白合成(CPM,×102)
Table 2 Protein synthesis of cutured cells
| |
BS组 |
DS组 |
GNS组 |
| MKN45 |
88.47±28.52* |
69.83±21.22 |
66.44±11.62 |
| NIH3T3 |
68.28±10.39 |
65.89±19.94 |
57.43±13.61 |
与DS及GNS比较，*P＜0.05
2.3 血清蛋白及C3 DS组与BS及GNS组比较，血清白蛋白、转铁蛋白、前白蛋白及C3含量差异均不显著(P均＞0.05)(表3)。
表3 血清蛋白及C3检测结果
Table 3 Proteins and C3 determination in serum
| 项 目 |
BS组 |
DS组 |
GNS组 |
| 白蛋白(g/L) |
37.0±5.6 |
36.1±4.3 |
35.5±7.6 |
| 转铁蛋白(g/L) |
28.4±7.7 |
29.7±4.6 |
28.2±9.3 |
| 前白蛋白(g/L) |
163.5±76.0 |
153.1±62.4 |
159.2±59.5 |
| C3(mg/L) |
586.5±116.0 |
585.1±205.1 |
546.6±133.1 |
3 讨论 目前临床上广泛应用的完全胃肠外营养(TPN)中氨基酸输液，均为平衡氨基酸，在给癌症病人提供营养基础上，有着促进癌瘤增殖的危险。改变某些氨基酸成分即无L-Val的“不平衡氨基酸输液”，针对性地治疗恶性肿瘤病人日益受到重视。川蒲幸光等［5］证明某些癌瘤病人应用减少或去除某些必需氨基酸(如L-Val)的不平衡氨基酸输液，可导致癌肿缩小，无引发负瘤宿主负氮平衡及免疫力下降现象；Nishihira等［6］对腹水肝癌细胞动物皮下移植模型进行无L-Val输液，癌瘤生长明显受抑，并显著提高化疗药物CDDP、MMC及肿瘤坏死因子的疗效；Goseki等［7］则证明无L-Met的TPN，也可抑制胃癌生长，并与5-Fu、CDDP及MMC有协同抗癌作用。本研究通过静脉内注射［1-13C］Leu示踪标记的“液闪法”，观察BS、DS及GNS对大鼠胃癌及切口肌组织蛋白合成的影响，发现DS输液组胃癌组织蛋白合成率明显低于BS组，而切口肌组织这两种输液组蛋白合成率差异不显著，表明无L-Val的氨基酸溶液的确可抑制胃癌蛋白合成，进而抑制其增殖，但对正常肌组织蛋白的合成影响不大。为去除胃癌组织中非癌细胞如成纤维细胞、间质细胞等对蛋白合成的影响，本研究还采用纯肿瘤细胞进行体外培养，用经上述三种不同输液处理过的大鼠血清继续进行孵育，通过3H-Leu掺入法来观察无L-Val溶液对培养细胞蛋白合成的影响，结果发现低分化胃癌MKN45细胞，DS血清培养组蛋白合成率明显低于BS组，而正常成纤维细胞(NIH3T3)对这两组输液蛋白合成率差异不显著，表明胃癌细胞在去除L-Val的情况下，蛋白合成确可受到抑制，而正常成纤维细胞因耐受无L-Val未受到类似影响。本研究负胃癌大鼠血清蛋白及C3检测结果，在三组输液间也未显示差异，表明至少短暂去除L-Val并不影响宿主全身营养及免疫力。
总之，根据胃癌细胞与正常细胞氨基酸代谢的不同及宿主对L-Val缺乏的一定耐受性，配制一种既能导致阻碍癌肿生长，又不引发负氮平衡和免疫力下降的无L-Val的不平衡氨基酸输液或协同其他疗法治疗胃癌，可能具有很大的临床应用价值。■
基金项目：浙江省卫生厅及国际食管病学会（ISDE）科研基金资助资助（批号：9619507）
作者简介：季峰，（1962-），男，江苏南京人，副主任医师，医学硕士，从事消化内科兼营养专业。
［1］胡 放，季 峰，陆汉明 等.胃癌癌区动静脉氨基酸差的分析［J］.中华消化杂志，1992，12：211.
［2］季 峰，胡 放.L-Val浓度对胃癌细胞DNA合成率及超微结构的影响［J］.肿瘤，1995，15：59.
［3］季 峰，厉有名，黄怀德 等.L-Val浓度对胃癌细胞抗癌药敏的影响［J］.浙江医学，1993，15：194.
［4］Lobley GE,Harris PH,Skene PA et al.Responses in tissue protein synthesis to sub and supra-maintenance intake in young growing sheep:compraison of large-dose and continuous-infusion tehniques［J］.British J of Nutrtion,1992,68:373.
［5］川蒲幸光.用不平衡氨基酸输液进行癌的治疗［J］.日癌治，1985，20：1093.
［6］Nishihira T.Anti-cancer therapy with valine-depleted amino acid imbalance solution［J］.Tohoku J Exp Med,1987,157:251.
［7］Goseki N,Maruyama M,Nagai K et al.Clinical evaluation of anticancer effect of methionine-depleting TPN with 5-Fu and/or MMC［J］.Gan To Kagaku Ryoho,1995,22:1028.
收稿日期：1999-03-10
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