金属蛋白酶抑制剂TIMP-2基因转染对胃癌细胞体内外生长侵袭与细胞外基质的相关性

世界华人消化杂志 1998年第8期第0卷 Original Articles

作者：李　楠¹　徐采朴²　宋　波²　刘为纹²　王　鑫³　张朝山³　徐元基³　冯东晓³

关键词：金属蛋白酶类/拮抗剂和抑制剂；金属蛋白酶类/药理学；胃肿瘤/病理学；肿瘤细胞，培养的；细胞外基质

Studies on the anti-invasive character of TIMP-2 gene transfected gastric carcinoma cells

LI Nan¹, XU Cai-Pu², SONG Bo², LIU Wei-Wen², WANG Xin³, ZHANG Chao-Shan³, XU Yuan-Ji³ and FENG Dong-Xiao³

　　¹Department of Gastroenterology, Navy General Hospital, Chinese PLA, Beijing 100037, China

　　²Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 430038, China

　　³Institute of Basic Medical Sciences,Chinese Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100857,China

　　Subject headings　metalloproteinases; stomach neoplasms/pathology; tumor cells, cultured; extracellular matrix

　　Abstract

　　AIM　To investigate the change of ability in tumor invasion model of nude mice with matrixmetalloproteinase-2 (TIMP-2) gene transfected tissue inhibitor, and the expression pattern of tissue inhibitor of matrixmetalloproteinases/matrix metalloproteinases (TIMPs/ MMPs).

　　METHODS　A full human TIMP-2 cDNA gene was constructed into virus rector PL-MT, and was transfered into human gastric carcinoma cells SGC-7901 and positive clone was selected by G418. Tumor invasion model was established by Boyden chamber in vitro and subrenal capsule in vivo. The changes of TIMPs/ MMPs were studied by immunohischemistry and in situ hybridization methods.

　　RESULTS　The expression of TIMP-2 gene in SGC-7901-T2 cells was higher than the SGC-7901 cells in vitro and the ability of invasion in Boyden chamber was weak in vitro. Type Ⅳ collagen was damaged in basement membrane of tumor invated lesions. The expression of membrane matrix metalloproteinase (MT-MMP) in SGC-7901-T2 groups was higher than SGC-7901 groups. The expression of TIMP-1, TIMP-2, MMP-2, MMP-9 and MT-MMP mRNA was not obviously changed in the two groups. The expression of MMP-2, MT-MMP proteins in tumor tissues was closely related to the degree of tumor invasion.

　　CONCLUSION　The TIMP-2 gene may be an important negative factor in gastric carcinoma cell invasion and metastasis.

　　中国图书资料分类号　R 979.1

　　摘　要

　　目的　探讨金属蛋白酶抑制剂(TIMP-2)基因转染后胃癌细胞的体内外侵袭能力的改变及胶原与胶原酶的变化规律.

　　方法　将人全长TIMP-2 cDNA基因构建于改构的逆转录病毒载体pL-MT，经基因转染法导入人胃癌细胞系SGC-7901，G418筛选获阳性细胞. 利用裸鼠肾包膜下移植模型，采用免疫组化和原位杂交方法，观察肿瘤发展过程中的不同时期TIMPs/ MMPs(基质金属蛋白酶)mRNA，Ⅳ型胶原表达的情况.

　　结果　随着肿瘤移植后时间的延长，瘤细胞侵袭基底膜处Ⅳ型胶原缺失，瘤巢周围MMPs含量丰富. 通过体外实验，观察到SGC-7901-T2细胞TIMP-2 mRNA及蛋白活性均高于母系SGC-7901细胞，TIMP-2可抑制基质金属蛋白酶的活性，减弱肿瘤细胞的侵袭体内外移动速度.

　　结论　MMPs的高表达是肿瘤细胞侵袭的关键因素，而TIMP-2基因是恶性肿瘤侵袭和转移的负调控因子.

　　0　引言

　　肿瘤的侵袭和转移是极其复杂的过程.近年研究表明，瘤细胞通过其自身或刺激宿主细胞分泌基质降解酶(如Ⅳ型胶原酶、粘蛋白酶等)以改变基底膜结构，破坏其屏障作用，从而侵袭周围组织. 但对于肿瘤发展的不同时期基质降解酶与其抑制物之间的平衡关系和Ⅳ型胶原分布变化的综合研究未见报道. 通过体内外结合的方法，我们在已构建的TIMP-2全长逆转录病毒载体基础上，研究TIMP-2基因转染后对胃癌细胞恶性生物学行为的影响，以期了解TIMPs/ MMPs与细胞外基质在肿瘤发展过程中的作用.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　含有TIMP-2基因的病毒载体(PL-MT-T2)真核表达载体由我室构建，已经测序及酶切鉴定方向正确^［1］. pLXSN空载体由军事医学科学院基础所沈倍奋教授提供. 人胃癌SGC-7901细胞系由第四军医大学西京医院消化病研究所提供；NIH3T3细胞、PA317细胞由军事医学科学院基础所提供.

　　1.2 方法

　　1.2.1　PA317病毒上清感染SGC-7901细胞　利用Liprofectmin 将pL-MT-T2质粒转染入包装细胞系PA317，经G418筛选获阳性克隆，用NIH3T3细胞测病毒滴度为(1～0.1)min^-1.L^-1，利用筛选的多克隆PA317上清感染SGC-7901细胞，再经G418筛选得阳性克隆扩大培养.

　　1.2.2 体外侵袭能力测定　Boyden Chamber侵袭小室试验^［4］，由饥饿24 h的NIH3T3细胞(无血清培养)收集的上清液做为趋化因子置于下室，中间是一层直径Φ 12 mm的聚碳酸脂膜，上敷含有Ⅳ型胶原和LN的基膜Matrigel胶，上室中加入含有肿瘤细胞的培养液，每毫升细胞计数3.2×10⁵个细胞，置CO₂孵箱中6 h，取出聚碳酸脂膜，擦去上面的Matrigel胶，记数背面穿孔的肿瘤细胞数做为肿瘤细胞的侵袭数，分别选4个视野，计算出平均值.

　　1.2.3 软琼脂上瘤细胞集落生长速度的测定　6 g/ L半固体琼脂培养基用含有LN的RPMI1640完全培养液及单纯的RPMI1640完全培养液配制后迅速加入24孔板内，静置，冷却凝固后，将瘤细胞悬液滴入培养板中，按7，10，14 d测集落半径，并计算培养后半径-培养前半径/ 培养时间算出平均生长速度(μm/ h).

　　1.2.4 体内侵袭动物模型建立　实验动物采用(4～6)周龄，体重16 g～18 g，BALBc/nu裸鼠共30只(购自军事医学科学院实验动物中心)体内侵袭动物模型制作，根据高进^［2］方法加以改进，采用无菌条件下将1 mm×1 mm×1 mm大小的新鲜瘤组织(经转染pL-MT-T2和未转染TIMP-2基因的SGC-7901细胞皮下种植的肿瘤块)移植于小鼠背外侧近中线肾包膜下，在移植后第7，12，30天分别取材，每组5只小鼠，带瘤肾组织一半Bouin液固定，进行组织学HE染色和免疫组化观察，确定肿瘤细胞侵袭程度. 另一半放液氮中保存，留做分子原位杂交染色观察.

　　1.2.5 免疫组化与原位杂交探针　TIMP-1 cDNA，TIMP-2 cDNA，MMP-2 cDNA, MMP-9 cDNA，MT-MMP cDNA分别由美国NIH国立癌症研究中心Liotta博士和日本Kannzan大学Sato博士赠送. 片段经酶切鉴定正确后回收，DiG标记.

　　1.2.6 免疫组化SP法　根据福州迈新生物制品公司SP即用型试剂盒说明书进行. 鼠抗兔Ⅳ型胶原单抗购自中山生物制品公司，抗体滴度1∶75. MT-MMP鼠抗兔抗体滴度1∶300，由日本Kazannzan大学癌症研究中心Sato博士惠赠. DAB染色，根据染色强度及范围评价其程度在石蜡切片上进行.

　　1.2.7 TIMP-2,TIMP-1,MMP-2,MMP-9和MMP-MT mRNA原位杂交　参照蔡文琴et al^［3］方法，在经DEPC处理过的石蜡包埋的组织切片上进行.

　　2　结果

　　2.1　TIMP-2基因转染胃癌SGC-7901的鉴定　用TIMP-2 cDNA探针和pLXSN逆转录病毒载体上的Neo^R基因PCR引物分别对经G481筛选的阳性SGC-7901克隆株细胞DNA行Southern blot和PCR分析，证明外源基因PL-MT-T2已成功感染了胃癌细胞SGC-7901，并稳定整合入细胞基因组中(传代2 mo后16次细胞中仍可检测到外源TIMP-2基因的存在).

　　2.2 TIMP-2基因mRNA在SGC-7901细胞中的表达　根据Kleiner et al^［5］方法，在SDS凝胶中含有一定成分的Ⅳ型胶原，上样液为转PL-MT-T2质粒的SGC-7901-T2和单纯肿瘤细胞SGC-7901的浓缩上清，电泳经活化24 h后再用考马斯亮蓝染色，经对比观察，SGC-7901细胞上清在凝胶中可表现出2条与Ⅳ型胶原酶标准品相同的2条区带；而转染PL-MT-T2质粒的SGC-7901细胞上清中，其降解Ⅳ型胶原底物的条带呈弥散，并且与Ⅳ型胶原酶标准品比较只有一条区带，另一条区带不清，甚至出现其他杂带^［6］.

　　2.3 Boyden Chamber侵袭小室实验　SGC-7901-T2细胞侵袭能力与未转染组相比明显减弱(P＜0.05，表1).

表1　各组细胞侵袭能力比较

　　2.6　免疫组化Ⅳ型胶原转染组　移植后7 d，正常肾组织内血管壁、肾小管基底膜和肾小球囊壁层Ⅳ型胶原染色呈连续细线状. 移植11 d在瘤细胞侵袭肾小管基底膜处出现Ⅳ型胶原缺失现象. 移植后30 d. 瘤巢周围基底膜Ⅳ型胶原少且不完整. 较对照组相比由于侵袭程度略轻，则Ⅳ型胶原酶破坏程度亦轻，但结果看出，在肿瘤侵袭的周边其膜型金属蛋白酶(MT-MMP)表达异常丰富，呈巢状或灶状分布，而MT-MMP丰富处，则Ⅳ型胶原缺失明显.

　　2.7 MT-MMP免疫组化　在瘤组织内有成巢状分布的MT-MMP，而且MT-MMP主要分布于肿瘤组织细胞间质中，在正常肾小管则为肾小管间质、上皮细胞分泌、瘤组织内的MT-MMP巢状分布与瘤细胞分化程度有关，MT-MMP成巢状分布处亦可能是瘤细胞分化差处.

　　2.8 原位杂交TIMP-2，TIMP-1，MMP-2，MMP-9及MT-MMP mRNA的表达　TIMP-1和TIMP-2 mRNA的阳性表达分布基本一致. 在瘤巢内呈散在或灶状分布，在不同时间取材标本中未见分布及含量有明显变化. MMP-2在正常肾脏中呈线条状、间段肾小管上皮基底部表达，与MT-MMP mRNA阳性表达相同，在侵袭Ⅱ，Ⅲ期时尤以肿瘤与正常肾组织接触的边缘呈细线条状密集阳性表达，大部分位于肾小管基底膜及肾小球间质中，与侵袭行为有密切联系. 因裸鼠数量少，未做统计.3　讨论

　　肿瘤细胞的侵袭和转移中基底膜的完整与否是限制肿瘤细胞移动的关键因素^［7］，已知构成基底膜的主要成分是Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、脂多糖等. 其中Ⅳ型胶原是其骨架、LN是其主要成分. 迄今为止，研究发现影响Ⅳ型胶原降解的金属蛋白酶含有二个亚型(matrix metalloproteinase-2/ -9)，分别降解Ⅳ型胶原的(Mr 92 000和Mr 72 000)2个亚型. 晚近发现的Ⅳ型胶原酶前体(membrane of matrix metalloproteinase MT-MMP)，不但参与了Ⅳ型胶原的降解过程，而且亦有激活MMP-2/ -9的作用，该二者的作用均可被其抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases TIMPs)所抑制. 但各亚型之间又互相区别^［8］. 影响基底膜的完整性主要是由基质金属蛋白酶及其抑制剂之间的平衡决定的. 具有转移倾向的肿瘤细胞可以分泌或刺激其他细胞分泌大量的金属蛋白酶以参与基底膜Ⅳ型胶原的降解过程，由于基底膜的破坏，使肿瘤细胞转移的天然屏障缺失，故导致瘤细胞向其他部位的浸润生长^［9,10］. 近年的研究证明金属蛋白酶抑制剂TIMPs基因的转入，使高侵袭、高转移肿瘤细胞其恶性转移表型得到下调^［11］. 体外侵袭能力受到抑制，但金属蛋白酶抑制剂对肿瘤细胞分泌MMPs作用的影响不同时相体内外作用至今未见报道，本研究利用TIMP-2基因转染的人胃癌细胞SGC-7901，结合体内外侵袭模型观察了TIMP-2基因作用发生的体内外时相和对肿瘤细胞侵袭能力的影响.

　　本研究表明，转染入TIMP-2基因的人胃癌SGC-7901-T2细胞体外侵袭能力较母系细胞减弱. 在实验中使用的matrigel胶主要成分是Ⅳ型胶原和LN，故瘤细胞降解Ⅳ型胶原的能力与TIMP-2的表达有直接关系，未转TIMP-2基因的SGC-7901母系瘤细胞其侵袭能力明显强于转染组，说明转染过量的TIMP-2入肿瘤细胞使其侵袭，移动的能力下降，且在前6 h内即有明显差别，说明TIMP-2作用的时间在肿瘤细胞侵袭行为的早期即发挥作用，软琼脂培养亦提示瘤细胞生长及形成克隆的能力呈持续性下降. 体内研究虽然原位杂交未能显示出转染组与未转染组各基因之间的明显差别，但MMPs和TIMPs分布的变化提示瘤细胞生物学特性改变在肿瘤灶的边缘MMP-2，MMP-9及MT-MMP表达丰富，而且主要是表现于实质瘤细胞的胞质，较瘤实质中心含量丰富. 而TIMP-1/ -2表达在周边与中心无明显差异，初步分析其原因可能与①TIMPs含量变化小，难以用cDNA-mRNA原位杂交显示；②外源基因TIMP-2基因转入，在体内细胞分化传代过程中发生了丢失或不能整合表达导致TIMP-2基因无改变，但原位杂交分布结果说明肿瘤侵袭程度与MMPs高表达有直接关系. 从裸鼠成瘤率下降、成瘤时间延长及侵袭程度减弱表明TIMP-2基因对瘤细胞的体内抑制作用，而且这种作用随着动物模型时间的延长，差异更明显. 免疫组化分析揭示了肿瘤侵袭灶周边有大量MMP-MT的表达和Ⅳ型胶原的破坏，明确提示MMPs是影响肿瘤浸润转移的主要因素之一. 而且表达中MMP-2,MMP-9及MT-MMP之间无明显差别，亦提示三者之间密切相关性，而且免疫组化结果与原位杂交结果趋势一致，为临床监测肿瘤侵袭的标志物筛选提供了理论和实验依据. 本文研究初步提示TIMP-2基因转染可使胃癌SGC-7901细胞的体内外侵袭能力得到下调，是抑制肿瘤转移的负调控因子.

　　李楠，男，1957-11-18生. 青岛市人，汉族. 1983年青岛大学医学院本科毕业，医学博士，副主任医师，肝病科主任，发表论文28篇，主要从事消化道肿瘤的基础研究和临床治疗.

　　全军九五重点攻关课题资助，No.960Z12.

　　通讯作者　李楠，100037，海军总医院消化科，北京市阜成路6号.

　　Key research project supported by the Whole Army 9th 5-Year Program.

　　Correspondence to:LI Nan, Department of Gastroenterology, Navy General Hospital, Chinese PLA, 6 Fuchenglu, Beijing 100037, China

　　Tel. +86·10·68587733-58401

　　收稿日期　1998-04-01

　　4　参考文献

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