采用改进的差示PCR技术分离胃癌差异表达基因的研究
世界华人消化杂志 1999年第2期第0卷 专家述评
作者：崔大祥 闫小君 苏成芝
单位：第四军医大学全军基因诊断技术应用研究所 陕西省西安市 710033
关键词：胃肿瘤/诊断；RNA，信使；聚合酶链反应；基因表达；基因诊断
中国图书资料分类号 R735.2
摘 要
目的 建立优化的mRNA差示PCR条件；运用建立的条件及GQS-9600分离胃癌GC7901与胃粘膜GES-1细胞株之间的差异表达基因片段；根据获取的序列，设计引物并运用于胃癌组织、血、活检胃粘膜标本检测，拟从中筛选出检出率与符合率高的数对引物，建立胃癌基因诊断方法.
方法 以胃癌GC7901与胃粘膜GES-1细胞株为研究对象，探索mRNA差示PCR的最佳反应条件，运用优化的条件分离细胞株之间的差异表达基因片段；以回收的片段作探针，打点杂交证实为真正的差异片段后，对纯化产物进行直接序列分析及GenBank同源性检索，同源性低的序列递交给GenBank；设计引物，采用RT-PCR方法对胃癌组织、血、活检胃粘膜进行检测，筛选出检出率与符合率高的5对引物建立多重PCR诊断胃癌方法.
结果 ①优化的差示PCR条件为：前5轮PCR循环采用94℃ 35s，40℃ 2min，72℃ 30s，后35轮PCR循环采用94℃ 45s，55℃ 2min，72℃ 1min，最后在72℃延伸7min；②确认并分离出差异条带154条，胃癌细胞株泳道中存在而胃粘膜细胞株泳道中缺失的有82条，胃粘膜细胞株泳道中存在而胃癌细胞株泳道中缺失的有35条，胃癌细胞株泳道中表达高于胃粘膜细胞株泳道中的有23条，胃粘膜细胞株泳道中表达高于胃癌细胞株泳道中的有14条，分别来自于H-T11G，H-T11A，H-T11C锚定引物的差异条带为61条，47条及46条；③从胃癌细胞株泳道中存在而胃粘膜细胞株泳道中缺失的82条带中随机挑选出17个差异片段作探针，进行打点杂交，证实在两细胞株之间呈差异表达；④对17个片段进行直接测序及同源性检索分析，其中7个新序列被GenBank接受，接受号为AF071052至AF071058；⑤GCYS-1，GCYS-4，GCYS-8，GCYS-10，GCYS-11号序列引物在26例胃癌标本中检出覆盖率为100%，在9例病理确诊的胃癌患者活检胃粘膜中检出率为100%，在17例病理确诊为胃癌患者血标本中检出率为53%，在其他组织中检出率较低.
结论 ①建立了优化的mRNA差示PCR技术的条件；②分离出了154个差异表达的基因片段；③对17个差异片段进行了测序及分析，其中7个新序列被GenBank接受；④建立多重PCR诊断胃癌方法.
Differentially expressed genes were
isolated in gastric carcinoma by
optimized differential display PCR
CUI Da-Xiang, YAN Xiao-Jun and SU Cheng-Zhi
Chinese PLA Institute of Gene Diagnosis of the Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China
Subject headings stomach neoplasms/diagnosis; RNA, messenger; polymerase chain reaction; gene expression; gene diagnosis
Abstract
AIM To set up optimized condition of mRNA DD-PCR and to isolate messenger RNA differentially expressed in cell line GC7901 or GES-1; so as to establish gene diagnosis method for gastric cancer.
METHODS By using cell line GC7901 and GES-1 as research targets, the optimized condition of mRNA DD-PCR was explored. Under optimized condition, cDNA fragments differentially expressed in GC7901 or GES-1 were isolated. Among these fragments 17 cDNA fragments were hybridized to total RNA of cell line GC7901 and GES-1, which were then sequenced and undertaken GenBank similar examination. By using obtained sequences, 17 pairs of primers were designed, and these primers were used to examine clinical samples.
RESULTS Optimized cycle parameters of mRNA DD-PCR for the first 5 round cycles were 94℃35s, 40℃2min; 72℃30s; and for the following 35 round cycles 94℃45s, 55℃2min; 72℃ 1min. By optimized mRNA DD-PCR and GQS-9600 type image and gene quantitive analysis system, 154 bands of cDNA fragments were obtained differentially expressed in cell line GC7901 or GES-1. Seventeen cDNA fragments were hybridized to total RNA of cell lines GC7901 and GES-1, which confirmed that 17 fragments were differentially expressed in GC7901 or GES-1. Sequencing and GenBank searching confirmed that 10 sequences were partially similar to sequences in GenBank, 7sequences were new sequences and accepted by GenBank, these accepted numbers were AF071052 to AF071058. By examining clinical samples, 5 pairs of primers with higher detection rates were screened out.
CONCLUSION Reliable optimized condition of mRNA differential display-PCR is established. 154 bands of fragments differentially expressed in GC7901 or GES-1 were isolated, of which 17 fragments were sequenced and 7 sequences among them were accepted by GenBank; 5 pairs of primers with higher detection rates in clinical samples were screened out and gene diagnosis method of gastric cancer is established.
0 引言
mRNA差示PCR(mRNA differential display PCR, DD-PCR)是目前筛选差异表达基因最有效的方法. 自1992年由Liang et al建立以来，已经筛选出一些与肿瘤等疾病相关的基因，显示出广阔的应用前景. 但是此技术存在一些不足之处，假阳性率高，后续处理繁琐等. 我们以胃癌细胞株GC7901与胃粘膜细胞株GES-1为研究对象，优化差示PCR条件，运用建立的条件筛选胃癌差异表达基因片段，利用获取的序列设计引物并运用于临床标本检测，拟建立胃癌基因诊断方法，为临床进一步开展胃癌基因诊断奠定基础.
1 材料和方法
1.1 材料 ①细胞株 胃癌 7901细胞株由第四军医大学动物实验中心提供，胃粘膜GES-1细胞株购自北京市肿瘤防治研究所. ②GQS-960型成像及基因分析系统系本所研制，PCR扩增仪系美国Barnstead公司产品. ③PCR产物纯化试剂盒及测序试剂盒分别是Promega公司的wizardTM PCR preps DNA纯化试剂盒，fmolTM sequencing kit，丙烯酰胺、双丙烯酰胺、尿素、Tris碱、EDTA皆购自华美公司. ④α-32P dATP，γ-32P dATP皆购自北京福瑞公司，PCR试剂系本所提供. ⑤26例胃癌及癌旁组织标本由西京医院王岭教授提供；9例胃癌患者活检胃粘膜标本由西安市中心医院提供；17例胃癌患者血标本由唐都医院张贺龙提供. ⑥差示PCR引物：采用GenHunter公司1996-04提供的序列，Venderbilt大学合成. 5’端引物为8条，3’端引物为3条，它们的序列为：
H-AP1:5'-AAGCTTGATTGCC-3',
H-AP2:5'-AAGCTTCGACTGT-3'
H-AP3:5'-AAGCTTTGCTCAG-3',
H-AP4:5'-AAGCTTCTCAACG-3'
H-AP5:5'-AAGCTTAGTAGGC-3',
H-AP6:5'-AAGCTTGCACCAT-3'
H-AP7:5'-AAGCTTAACGAGG-3',
H-AP8:5'-AAGCTTTTACCGC-3'
H-T11G:5'-AAGCTTTTTTTTTTTG-3'
H-T11A:5'-AAGCTTTTTTTTTTTA-3'
H-T11C:5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3'
1.2 方法 ①常规培养胃癌7901细胞株，按文献［1］培养胃粘膜GES-1细胞株. ②采用异硫氰酸胍一步法分离细胞株、组织及血标本中的总RNA，用无RNase的DNase去除其中的DNA，紫外扫描定量后稀释成0.1g/L，于-20℃保存. ③mRNA反转录 以H-T11M(M=G,C,or A)，为起始引物，依次加入无RNase的水9.4μL，5×RT Buffer 4.0μL，dNTP (250μmol/L) 1.6μL，总RNA(0.1g/L)2.0μL，H-T11M 2.0μL，反应条件为：65℃ 5min，37℃， 60min，75℃ 5min，MMLV反转录酶(108U/L)在37℃ 10min时加入. ④PCR扩增 标记好Eppendorf管，依次加入ddH2O 9.2μL，10×PCR buffer 2μL， dNTP (25μmol/L) 1.6μL，H-AP(1-8) 2.0μL，H-T11M 2.0μL，反转录产物2.0μL，α-32PdATP 0.5μL，混匀后加入1.5U Taq酶，最后加入30μL石蜡油. ⑤PCR反应条件：前5个循环条件为94℃ 35s，40℃ 2min，72℃ 30s；后35个循环条件为94℃ 45s，55℃ 2min， 72℃ 1min，最后在72℃延伸7min. ⑥60g/L测序胶电泳：配制60g/L聚丙烯酰胺凝胶，充分聚合2h后，预电泳30min，各取3.5μL PCR产物加入2μL载样液在80℃变性5min后上样，1700V，25W电泳4.5h，揭下湿胶，直接放射自显影14h～18h. ⑦差异条带的确认 采用本所研制的GQS-960型成像及基因分析系统，扫描确认位置异常及同一位置但光密度不一致的条带为有意义的差异条带. ⑧差异条带的回收 从胶上切下被确认的条带，加入100μL三蒸水，煮沸10min，离心收集上清到一新管，加入10μL 3mol/L醋酸钠，5μL糖原(10g/L)，450μL无水乙醇，冰浴30min，4℃离心沉淀cDNA，去除上清，用200μL预冷的850mL/L乙醇悬浮cDNA，离心后去除残留乙醇，溶沉淀于10μL水中. ⑨差异条带的二次扩增：取4μL回收的产物作模板，依次加入ddH2O 20.4μL，10×PCR buffer 4.0μL, dNTP(25μmol/L) 3.2μL，H-T11M(M=G, C or A) 4.0μL，混匀后加入Taq酶1.5U，最后加入30μL石蜡油. PCR循环条件为：94℃ 45s，55℃ 2min， 72℃ 1min，30个循环，最后在72℃延伸7min. ⑩用纯化试剂盒按说明书纯化PCR产物. B11采用末端标记法在PCR产物末端标记上γ-32P dATP作探针，对胃癌及胃粘膜细胞株总RNA进行打点杂交［4］. B12对纯化的二次扩增产物直接进行序列分析［4］. B13对PCR产物测序结果进行GenBank同源性检索，确认为新序列后，把PCR产物克隆入T载体，同时递交给GenBank［2，3］. B14根据获取的序列，设计引物，运用RT-PCR方法对收集的标本进行检测［4］. mRNA反转录：10×RT buffer 2μL，10mmol/L dNTP 2μL， oligo(dT) 2μL，RNasin 1μL (20U/μL)，无RNase水10μL，总RNA模板2μL (0.2g/L)混匀后，离心数秒，采用65℃ 5min，37℃ 60min，75℃ 5min，MMLV反转录酶在37℃ 10min时加入. PCR扩增：取反转录产物2μL作模板，依次加入ddH2O 21μL，10×PCR buffer 3μL，2.5mmol/L dNTP 3μL，上下引物各取1μL，Taq酶1.5U，混匀后，离心数秒，加入30μL蜡油，采用94℃ 35s，55℃ 55s，72℃ 1min，35个循环，最后在72℃延伸7min. 结果判断标准：每次设立阳性、阴性对照，以总RNA量0.4μg为模板，反转录PCR重复扩增2次皆成功为阳性，否则为阴性.
2 结果
2.1 PCR循环参数的确立 采用Liang et al［6］的PCR循环参数，即94℃ 30s, 40℃ 5min，72℃ 30s，40次循环，测序胶电泳结果示差异条带太多，在200bp以下差异条带看不清楚；采用Ayala et al［8］的PCR循环参数，即第1轮PCR采用94℃ 1min， 40℃ 4min, 72℃ 1min，随后35个循环采用94℃ 45s,60℃ 2min, 72℃ 1min，差异条带重复性较好，但差异条带明显减少，背景明显增强. 重复3次后，最后确认的PCR循环参数为，即前5轮PCR采用94℃ 35s, 40℃ 2min, 72℃ 30s，后35个循环采用94℃ 45s, 55℃ 2min, 72℃ 1min，经这样的改进，既保持了差异条带的敏感性及特征性，又保证了差异条带的重复性，同时背景清晰.
2.2 GQS-960型成像及基因定量分析系统扫描结果 扫描获得差异条带共154条，胃癌细胞株泳道中存在而胃粘膜细胞株中缺失的有82条；胃粘膜细胞株中存在而胃癌细胞株中缺失的有35条；胃癌细胞株中表达高于胃粘膜细胞株中的有23条；胃粘膜细胞株中表达高于胃癌中的有14条，它们分别来自于H-T11G，H-T11A，H-T11C锚定引物的差异条带为61条、47条及46条.
图1 差示PCR部分电泳结果(1与2中存在表达量不同的差异条带，3与4中存在彼此缺失的条带).
2.3 打点杂交结果 从胃癌细胞株泳道中存在而胃粘膜细胞株泳道中缺失的82条差异片段中随机挑取17个片段作探针，进行RNA打点杂交，证实17个片段在胃癌细胞株中呈高表达，而在胃粘膜细胞株中呈低表达(图2).
图2 打点杂交结果(1-6为相应片段杂交结果，上为GC7901总RNA，下为GES-1总RNA).
2.4 PCR产物部分测序结果 被GenBank接受的序列为：GCYS-1片段(AF071052)，AP2与D-T11G为引物：
5'AAGCTTCGAC TGTGAATGGA ATGTTGTGGC GTGTCTGGAT CGTATGTCTG TTCTGTGCCA GATGAGCTGT
CAGTCCAGTT CCAGCCTGAC TCGCAGTTGG CTACCGGATC GCTATCCGCG ATGGCTGGAC
CAGGACGATC GATCGAGTCG ATCTGGCAGT CTTGATCCCT TGGACTGTGG GCCGACGACA
GTCGCGGATC GATCCGAGCG CGCGATCCAG CAGGCTGGTC GATCGGTTCT GGTCGGTCTG
CAGCAGATCG GATCGATCGC CATCTCGTCG GTGGATCCTG TCAGCCTGGT GTATTTGTGC CGG3'
GCYS-2片段 (AF071053)， AP5与D-T11A为引物：
5'AAGCTTAGTA GGCGCCGCCG GACCAGCGGA CCGGGGCCGC TTTGCACCAG CAGCGCCCGT
GGGCACCAGC CAGCCACTCG CGTCCCCGTA CAGTAGAGCT TGATCCTGGA CTGCTGCGCG
GACACGCCTG GGCGGTAGGC GCACGGGACA GTGTCAGTC TGCAACTACC ACGGTGTCGG
CGTGAGCCAA GGGCTAAGCC CATCTGACCG GGACGGCCGC TGCGTGTCCA
ACGGAGTGGG GCGGCTAACC AGGACCTTAC GGGCCCTAAG ATACTCGAGG
ATCGGGCCCT AAGAGGAACG
CCCGGTAAGA CTCCTCTGGC TGGCTGCCTA AGGCCCTAGC TGGCCTATAG ACTCGTACTC
TCTCCTAGAG CCGGCCTTAG CAGTAGCGCG TAAAGCCTAA GACTGGCCTT AGGTGACTGA
AGGGCAGAGT AGAGCTAGTT AAGTTCAAGA CTGAGTTAAA GCGATTACGT AGACCTAGAA
TCAAGGATCC TTAGGTGACT GAAGGGCAGA GTAGAGCTAG TTAAGTTCAA GACTGAGTTA
AAGCGATTAC GAGACCTAGA ATCAAGGATC TTAGACCAGA CCTGGGAAGC TGGTTACCTG
GGATCCTGTG C3’
GCYS-3片段 (AF071054)， AP7与D-T11A为引物：
5'AAGCTTAACG AGGGACAGAC CTGTCGCCGC GGCTCGCGAC GGCTAGCTGC ACTGCTGCCT
GTCCGAGTCA GTCGTCGTCG ATCGCCTTGG GCCTTCTCGG CTTGTGGCGG AGTGCTCCGT
GTGTGGCTAC TACTTCTAGG ATCGCTACGC TGGTACTAGC TAGCAGCCGC TACTCGGCCC
TAGCTGACTG ACGATGCTCT CGTCGGAGTA GGCAGTCAGC TCTGGTCAGC GTCATATCAT
CCAGTCCATC GGTCATGCTA GACTCTGCTA GCTCTCTGCA TGTCTGTCTC TCGATCAGGA
TCAGTCGGCG ATCGGTATCT TGTTCCTTGC CCAGCCATCG ATCTCCTGGC AATACGCCTC
AGCCTAGCAG ACCGCCTGCA GGTACCGGTC CGGAATTCCC GGGTCTGGAC CGTCCGCGGA
CGCGTGGGTT ATCTCTCACA ACTGAAGTCC CCATTAGATA AATCTAGAAC CAAATGTTAG
ATAAGCACAT GTCCGGCCCA GAAAAGAGAG AAAGTTAAAA AAAAAAAAAA3'
GCYS-4片段 (AF071055)，AP3与D-T11C为引物：
5'AAGCTTTTAC CGCCTAGCCA GGACCAGCCA GCCGGAGACC GGAGTCCGAG AGACGCAGAC AGCAACAGAC
GAGAGACAGC CAAGGTACGA TCAGCAGCAC CAAGCCAAGA AGCCTAAAGA GCAGTCAGAC CTGACTGCAG
CAGCACGCTC GCACTCGCCA GAGCACAGCA GCACTGACAC AACTACAGCC ATAGCGAGTC ATAGACAACA
CCCAACACAC TAATCCTATC TAATTTGGCC CACTCCTC3'
GCYS-5片段 (AF071056)，AP8与D-T11C为引物：
5'AAGCTTTTAC CGCCAACCCA CACCAACAGT CCAGCCAAAA AAAATTAGTT CGTGACTTGC ATGAGCGATG
CTAGCACTAG ACTGACTGAAG CGGCAACTGC AGGTCCGAAG TCGTCTGAGT ACGTCCGCAG ACAGTCTTGG
ACGGCTATGAC GGTCGCATGC AGCGTGTACG TGTGTGGTGT GGTAGAGCTG CCGCGCTTTG TGTGTGTTGT
TGTGTGTGTG TGTGTTATAT CGAGCGGTGG TAAAGTCTGA CACCATAACA CTTTAAAATA TTGTATTTAT
TCATTCAAAA TTCATTGAAA AATCACATGC TATTATATAT TAAAATTATG TGATTATTTT ACAAAATTAG
ACTTACAGAA AAGAACTATT TCCTACCCAA AAAGCTGTTAT GGTTATATGC
AGCATGTTTT
GAAAAAAAAAAAAAAA 3'
GCYS-6片段，AP7 (AF071057) 与D-T11C为引物：
5'AAGCTTAACG AGGTCCCCGT GATGCAGCTG CCCCGGGCAC CGACCAGCGA TGTGCTCTCA
GCCCCCGACA GGTTTCCTGG AAGATGGCGC CATTCTGGAT GATGCGGGGG CACTTGCGGT
AGAAGACACG CACGGCGATG AGGGACATGC AGCCGCCATA GTCCTGGAAG CCAGGTAGAA
GCCGCTGCGG TGACACAGGT CCGAAGCTCC GCACCTCGGT CGTTGACGTT TCATGACGGC
GGCCACCTCA GGTCCACCTG GGAGAAGCTC TCGTCGGCTG CAATGGTATC CACCTTCACC
CATGGATTCT CCATCCAGTT GGGGAAGGTT GGGCGTAGTA TCATGGTCAT AGCTGTTTCC
TGTGTGGAAA TTGTATCCGC TCATAATTCC AGACTACATG ACGGAGCCGG
AAGCAT3'
GCYS-7片段 (AF071058)，AP7与D-T11C为引物：
5'AAGCTTTGCT CAGCAGATGA TCCTACAACT GCGACACTAT CATGCGCGCT CGCTACTAGA TAAGTCACTC
GACAGTGCT ATATTGACTGA CGTACGATCG ACATCGTTGG ACTATCCAGA GTCATTGAAG ATATGTATGG
AGTGATTTCA TCTGAAGAAT GACATATCTT TTATGGATCG GACACATTGG TACAGAGACT ACCGGATACG
ACGACAGACT GATAATTAGG AGCCTTCGAT ACTACTACGA CGTATCGATA CCAGTCAGTC ATCAGGACAA
CGAGCTGCGA CGTTGGTCGC TTGCATGTCT GCCTATGTGT CTCATCAAGG CACCGGTACG GCACCGCAGT
ATCACCGATA TTGGAGTACA GGACTTAATC ACG3'
2.5 引物设计结果
P1AGCAGATAGTCAGACAGTCG, P2GATATGTCATTCTTCAGATG; P3ATGGAATGTTGTGGCGTGTC, P4AGTCGGAC
CACATAAACACGGCC;P5TAGGCGCCGCCGGACCAGCGGA,P6ACTGGCCTTAGGTGACTGAA;P7TATGGTTATATGC
AGCATGT,P8ATACCAATATACGTCGTACA;P9TGATGCAGCTGCCCCGGGCAC,P10TCTGATGTACTGCCTCGGCCAA
2.6 临床标本检测结果 运用此五对引物及RT-PCR技术对26例胃癌组织标本中检出覆盖率为100%；对17例血标本检出率为53%；对9例活检胃粘膜检出覆盖率为100%.
3 讨论
mRNA差异展示PCR(mRNA differential display PCR)是目前筛选差异表达基因最有效的方法［2，5，9］. 1992年Liang et al［6］建立此方法时，5’端采用20条随机引物，每条由10bp组成，3’端采用12条锚定引物，每条由14bp组成，采用的PCR参数为94℃ 30s, 42℃ 1min, 72℃ 30s，40个循环. 最后在72℃延伸5min，这种方法获得的差异条带太多，重复性尚可，但是假阳性率达70%左右，差异片段在500bp以下. 为了尽可能去除多余的无特征性的条带，增强在Northern blot上重现率，克服假阳性，Ayala et al［8］于1995年对PCR条件进行了改进，第1轮PCR采用低严谨性，94℃ 1min，40℃ 4min, 72℃ 1min，随后35个循环采高严谨性，退火温度采用60℃，获得了很好的重复性及敏感性，假阳性率明显降低，最长的差异片段为700bp左右. 我们摸索PCR循环参数时，先采用了Liang et al的循环参数，结果显示差异条带太多，随后我们采用了Ayala et al人的参数，结果显示条带虽减少重复性增强，但背景明显增强. 我们采用的5’端引物，每条由13bp组成，Tm为38℃，3’端引物，每条由16bp组成，Tm为38℃，Tp值为54.5℃. 我们比较后认为，我们采用的引物最适起始温度Tp值为54.5℃，在不知道扩增片段长度及序列的情况下，必须考虑Tp值，而最佳复性温度为Tp±2℃～5℃，因此我们摸索后建立的条件为：前5轮的PCR参数为94℃ 35s, 40℃ 2min, 72℃ 30s,后35个循环采用94℃ 45s, 55℃ 2min, 72℃ 1min. 结果证明条带数量适中，背景清晰，尤其是重复性特别好，杂交证实假阳性率显著降低. 因此，我们认为，我们改进的差示PCR循环参数值得推荐［7-10］.
我们从获取的差异条带中随机选择了17个差异片段，进行了纯化并取出一部分作为探针，与GC7901及GES-1总RNA进行打点杂交，证实17个片段皆在两者之间存在差异表达，假阳性率为0. 此结果也证明了选择第三代DD-PCR引物及建立的PCR循环参数是正确的，它克服了假阳性率高的缺点［5-10］. 根据打点杂交阳性结果，我们认为，17个差异片段是真正的差异片段. 我们对17个片段进行了测序，其中7个序列为新序列，被GenBank接受. 我们对获取的差示PCR产物后续处理进行了改进，二次扩增的产物直接纯化，进行RNA打点杂交确认为非假阳性产物后，直接进行序列分析及GenBank检索，证实为非同源性的序列后，才进行克隆. 这样不仅降低了工作量，提高了效率，而且还确保了克隆片段为有意义的序列，完全避免了先克隆、后测序的盲目性［7］. 我们对获取的17个新序列重新设计了17对引物，设计的引物经计算机分析后认为，设计的引物具有特异性. 通过对GES-1及GC7901细胞总RNA的RT-PCR及临床标本检测，筛选出在临床标本中检出符合率高的5对引物进一步用于临床标本检测及研究. 经统计学分析处理后认为，这五对引物的产物可能与胃癌的早期状态及进展期状态有关. 通过对26例胃癌临床标本的检测分析，发现了5对引物在26例肿瘤标本及活检胃粘膜中检出覆盖率为100%，能够避免肿瘤的漏检，但是是否对所有的胃癌患者完全避免漏检，还有待于进一步验证. 总之，这5对引物的产物在胃癌中的检出率高于其他肿瘤，表明相对特异性较好，而且经临床标本验证及统计学分析表明，皆与胃癌的癌前病变及进展期有关. 因此，我们认为，怀疑为早期胃癌患者应进行这5对引物检测，若阳性，则必须进一步检查确认患者处于癌前病变或进展期胃癌.
我们利用筛选出的特异性相对较好，检出符合率较高的5对引物，对病理确诊的17例血标本检出53%(9/17)的阳性结果，表明PCR以血为标本进行胃癌诊断具有局限性. 血标本检测是一个令人争议的问题. 血中的特异模板是来自何处目前认为，血中的特异模板来自微转移. 肿瘤的浸润与转移是一个多阶段过程. 肿瘤细胞的脱落、侵袭并进入循环，仅是这一过程的最初阶段，但也为最终形成临床转移灶提供了可能［10,11］. 血标本进行这五对引物RT-PCR检查，可判断有无微转移灶存在，若为阳性，则表明有微转移灶存在，是患者不良预后的一个重要指标：也是疗效和早期复发监测的指标. 本实验还有一大特色就是采用我所研制的成像及基因定量分析系统，不仅对明显位置差异的条带能够区分出来，而且还对表达量上的差异条带区分出来，增强了敏感性. 这样不仅保证了差异条带能够完全获取，避免了遗漏，而且为进一步筛出全部有意义的差异表达基因奠定了基础. 我们正在对获取的所有片段进行研究. 我相信，只要对全部的差异条带研究之后，才能够找出可能用于胃癌诊断的基因标志物.
总之，我们建立了优化的差示PCR循环参数，建立了更合理的差示PCR后续处理步骤，获取了154个差异表达片段，对其中17个片段进行了序列分析与GenBank检索，其中7个序列被GenBank接受. 通过对临床标本检测，筛选出检出符合率高、特异性好的五对引物，为临床开展胃癌的基因诊断打下基础，同时也为进一步研究这七个新基因的功能打下基础.
作者简介:崔大祥，男，1966-02-03生，安徽省桐城县人，汉族. 1990年第二军医大学毕业，1995年第四军医大学肿瘤学硕士，1998年第四军医大学分子生物学博士，主要从事肿瘤研究，承当国家自然科学基金课题(No.39470683)一项，发表论文20篇.
通讯作者 崔大祥，710033，第四军医大学全军基因诊断技术应用研究所，陕西省西安市长乐西路17号.
Correspondence to:Dr. CUI Da-Xiang, Chinese PLA Institute of Gene Diagnosis, 17 Changle Xilu, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China
Tel. +86·29·3285729
E-mail. Cuidx@igd. edu. cn
4 参考文献
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收稿日期 1998-07-15
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