DT/VEGF系统对胃癌细胞的杀伤效应

世界华人消化杂志 2000年第4期第8卷 研究原著

作者：潘 欣　柯重伟　潘 卫　贺 祥　曹广文　戚中田

单位：潘 欣　潘 卫　贺 祥　曹广文　戚中田（中国人民解放军第二军医大学微生物学教研室上海市 200433）；柯重伟（中国人民解放军第二军医大学附属长海医院普外科 上海市 200433）

关键词：白喉毒素基因；血管内皮细胞生长因子基因；外显子7基因；真核表达载体；胃肿瘤；基因治疗

　　摘　要：目的研究DT390基因与VFGF及其外显子7基因融合后对胃癌细胞的杀伤作用，探索毒素融合基因治疗胃癌的有效途径。方法构建携带DT390-VEGFl65或DT390-VEGFexon7融合基因的真核表达载体，用脂质体介导转染胃癌细胞SGC7901，观察胃癌细胞的形态变化。结果5μg真核表达构建物转染5x105个胃癌细胞/孔(24孔板)96h后发现，转毒素融合基因的细胞90％死亡，而对照细胞形态正常。结论融合基因可以在胃癌细胞中表达并发挥杀伤肿瘤的作用。

Killing effect of DT/VEGF system on gastric carcinoma cell

Xin Pan(Department of MicrobiologyHospital,Second Military Medical University,Shanghai200433,China)

　　chong Wei Ke(Department of Surgery of Affiliated Changhai Hospital,Second Military Medical university,Shanghai 200433,China)

　　wei Pan , Xiang He ,Guang Wen Cao ,Zhong Tian Qi(Department of MicrobiologyHospital,Second Military Medical University,Shanghai200433,China)

　　Abstract：AIM to study the killing effect of the fusion gene consisting of DT390-VEGF165 or dT390-VEGFexon7 on human gastric carcinoma cell.METHODS The eukaryotic expression vector carrying DT390-VEGF165 or DT390-VEGFexon7 gene was constructed.The eukaryotic expression constructs were introduced into gastric carcinoma cell SGC7901 by means of lipofectamine-mediated gene transfer procedure. The cytolytic effect of the chimeric gene was registered by photomicrngraphy.RESULTS The most gastric carcinoma eslls of 5×l05 calls/well were cytosis after transferred with 5μgeukaryotic expression constructs 96 hours later, but the control cells were normal.CONCLUSION The chimeric gene can be expressed in the gastric carcinoma cell and result in obvious antitumor effects.

　　Keywords：diphtheria toxin gene;vascular endothelial growth factor gene; eukaryotic expression vector; stomach neoplasms; gene therapy

　　O引言新血管生成是肿瘤原发灶扩展和转移灶形成的基础，而抑制血管再生可能是治疗实体瘤的有效途径。目前大量的证据表明，肿瘤血管生成的主要调控者是血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)，VEGF的5种异构体中VEGP165是表达丰度最高的异构体，KDR和Flt-1为VEGP的高亲和受体，Flt-1和KDR在内皮细胞(endothdlialcell，EC)和几种非EC型细胞如NIH3T3，Balb／c3T3，人黑素瘤，HeLa细胞上表达[1]．1996年Sokeretal[2]在EC和各种肿瘤细胞系上发现了仅与VEGF165结合的受体，即VEGF165R，该受体与VEGF165外显子7编码的结构域(VFGFexon7)结合.目前将细菌毒素的跨膜结构域和酶性结构域与细胞因子或抗体构成的融合蛋白靶向杀伤各型细胞的研究已有大量报道，但这些融合毒素仅对某些类型的肿瘤有效，为扩大癌症治疗范围，我们选择VEGF165和VEGFexon取代细菌毒素的受体结合结构域而与其跨膜结构域和酶性结构域融合以选择性毒杀肿瘤血管．白喉毒素(diphtheriatoxin，DT)是由535个氨基酸残基组成的可分泌性蛋白，Mr58342，其中DTA片段(1～193残基)可使真核细胞中EF-2因子上的ADP核糖化而失活EF-2，造成胞内蛋白质合成受阻，最终导致细胞死亡；CTB片段(194～535残基)与细胞表面结合将DTA片段转位至胞质，其中390～535氨基酸残基组成DT的受体结合结构域，该区域可设计用细胞因子取代而靶向目的细胞[3]．本研究中，我们构建了携带DT390-VEGF及DT390-VEGFexon7基因的真核表达载体，转基因后结果显示：融合基因表达的蛋白质可以杀死肿瘤细胞，是一种广谱肿瘤疗剂．本研究也为后续开展组织特异性基因治疗下作打下了基础。1材料和方法1．1材料pET15b-DT由美国Muler教授惠赠,pcDNA3．1(+)真核表达载体由美国FDA李忠民博士惠赠，pBV220-VEGF由上海复旦大学遗传所遗传工程国家重点实验室谢毅教授惠赠，PCR产物克隆载体pMl)18-T为TaKaRa公司产品；胃癌SGC7901细胞由上海第二军医大学附属长海医院消化科惠赠；工程菌DH5a为本室保存；TaqDNA多聚酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶等均购丁华美生物工程公司；LowDNAMassTMLadder，G418，DMEM，LipofectamineTM为Gibco产品；PCR引物由Takara公司合成：1．2方法1．2．1目的基因克隆DT390基因的PCR引物根据Muler提供的DT基因序列设计，引物1引入HindⅢ位点和Kozak序列，引物2引入MluI位点，VEGF165及VEGLexon7基因的PCR引物根据Davidetal发表的VEGF基因序列设计，引物3和引物5引入MluI位点和Kozak序列，引物4和引物6引入强终止信号和HindⅢ位点．PCR的反应进程如下：94°C变性2min;94°C变性30s，50°C复性30s，72°C聚合延伸反应1．5min，共循环30次；最后，72°C聚合延伸反应10min．产物经纯化后，分别克隆到pMDl8-TPCR产物克隆载体上，用M13引物进行DNA自动测序．1．2．2真核表达载体的构建用HindⅢ／MluⅠ分别将DT390，VEGF165，VEGFexon7从携带目的基因的pMDl8-T载体上游离下来，用HindⅢ酶切pcDNA3．1(+)载体使之线性化后再进行去磷酸化，在T4DNA连接酶作用下，将线性化的pcDNA3．1(+)分别与HindⅢ-MluIDT390片段和MluI-HindⅢVEGFl65片段以及HindⅢ-MluIDT390片段和MluI-HindⅢVEGFexon7片段进行连接，转化DH5a钙化菌，分别挑取克隆进行质粒的小量制备；以HindⅢ酶切鉴定阳性克隆，以载体上的MluI位点(距起始位点228bp)同插入片段上的MluI位点联合酶切鉴定插入方向，同时用T7引物进行DNA自动测序以确认读框正确。1．2．3DT390-VEGF165及DT390-VEGF-VEGFexon7融合基因在人胃癌SGC7901细胞中表达在24孔板中按5x105个细胞/孔接种人胃癌SGC7901细胞，待细胞生长至80％融合时，以含5μgpcl)NA3．1(+)-DT390-VEGF165DNA或pcDNA3．1(+)-DT390-VEGFexon7DNA和3μLLipofectamineTM及0.5mL无血清DMEM培养基混合液转染；对照分别为反向插入的pcDNA3.1(+)-DT390-VEGFexon7R以及LipofectamineTM，剂量及操作同上；5h后，加入0．5mL含200mL/L小牛血清DMEM培养基再培养48b后，补充1mL含200mL/小牛血清DMEM培养基，继续培养至90h，在显微镜下拍照记录结果。2结果2．1目的基因PCR扩增结果完整的DTDNA全长1608bp，经PCR后，白391～535氨基酸残基组成DT的受体结合结构域被删除；完整的VEGF165(含信号肽)DNA全长573bp，VEGFexon7DNA全长132bp，为使融合分子DT390-MEGF165及DT390-VEGFexon7中的白喉毒素和VEGF165或VEGFexon7分子能自由折叠，在DT390的端和VEGF165或VEGFexon7的5端加入MluⅠ位点，也即增加了两个氨基酸残基，TR(图1)。图1DT390，VEGF，exon7基因PCR扩增电泳图。1：LowDNAMassTMLaddr：2．Okb，1.2kb，0.8kb，0．4kb，0.2kb，0.lkb；2；1．17kbDT390DNA；3：0．57kbVEGFDNA;4:0.13kbVEGFexon7DNA2．2嵌合基因真核表达载体的构建、酶切鉴定及测序 结果将PCR扩增的目的基因分别接亚克隆于pMDl8-T载体上，然后将目的基因取下，与经相应酶切的pcDNA3．1(+)相连，嵌合基因真核表达载体构建过程见图2．质粒酶切鉴定图谱见图3．图3真核表达载体pcDNA3.1(+)-DT390-VEGF165/VEGFexon7酶切鉴定图谱。1：pcDNA3.1(+)-DT390-VEGFl65DNA(MluI);2：pcDNA3.1(+)-DT390-VEGFexon7DNA(MluI)；3：PcDNA3.1(+)-DT390-VEGFexon7DNA(MluI)；4:LowDNAMassTMLadder;5:pcDNA3.1(+)-DT390-VEGFexon7RDNA(HindⅢ);6:pcDNA3.1(+)-DT390-VEGFexon7DNA(HindⅢ)；7:pcDNA3.1(+)-DT390-VEGF165DNA(HindⅢ);测序结果与原序列相比，所得DT390基因序列中第148位的Glu(gaa)→Ser(tcc)，第377位的Arg(cgt→Arg(agg)，第378位的Pro(ccc)→Pro(cct)，该结果不影响DTA毒性；VEGFl65基因序列中第15位的Leu(crc)→Leu(ctt)，第130位的Cys(tgc)→Cys(tgl)，该结果不影响VEGF165活性；VEGFexon7基因序列与原序列完全相同；正反向插入序列在pcDNA3．1(+)载体中的测序结果表明融合分子在接头处读框正确.2.3人胃癌SGC7901细胞转染pcDNA3．1(十)-DT390-VEGF165/VEGFexon7融合基因后的生长状况胃癌SGC7901细胞转染96h后，转pcDNA3．1(+)-DT390-VEGF165/VEGFexon7融合基因细胞大多溶解、邹缩死亡(图4)．此结果表明，融合基因在细胞中得到了表达，且有明显的细胞毒性．实验结果提示pcDNA3．1(+)-DT390-VEGFexon7的细胞毒性略优于pcDNA3．1(+)-DT390-VEGF165·图4胃癌EGC7901细胞转基因生长状况。A：DNA3．1(+)-DT390-VEGFexon7转染胃癌SGC7901细胞96h后细胞出现溶解邹缩死亡；B：pcDNA3．1(+)-DT390-VEGF165转染胃癌SGC7901细胞96h后细胞出现溶解；C：pcDNA3．1(+)-DT390-VEGFexon7转染胃癌SGC7901细胞96h后细胞形态正常；D:LipofectamineTM转染胃癌SGC7901细胞96h后细胞形态正常。3讨论DT作为生物导弹的弹头药物之一，常用来对肿瘤和HIV感染进行治疗研究．DT蛋白质可分成3个功能区段，I区[氨基酸(AA)1～192]ADP-核糖基转移酶活性区,Ⅱ区(AA205～378)主要负责跨膜转位，Ⅲ区(AA386～535)主要负责与靶细胞受体结合，Ramakrishnanetal[5]使用DT385与VEGF的化学嵌合蛋白研究时发现DT的功能发挥得不理想，我们选择了I区、Ⅱ区和部分Ⅲ区基因为克隆对象，其受体结合区用VEGF165或VEGFexon7取代。从所获融合基因在胃癌SGC7901细胞中表达的结果可知，融合蛋白的活性发挥正常，DT390和VEGFl65或VEGFexon7之间没有构象上的互相干扰，融合基因的详细生物活性正在进一步检测之中。本实验为深入开展肿瘤组织特异性基因治疗提供了初步依据。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目，No39770834

　　作者简介：潘欣，女，1968年10月出生，湖北省武汉市人，汉族。1991年湖南师范大学生物系毕业，1994年湖南师范大学生物系蛋白质化学硕土，微生物学讲师，博士，主要从事肿瘤基因治疗研究，发表论文5篇。

　　参考文献：

　　［1］Pan X,Cao GW,Ke ZW,He X,Qi ZT.Structure and function of vascular endothelial growth factor and its related proteins.Shengwu Huaxue Yu sheng Wuli Xuebao,1999;31:357-361

　　［2］Soker S,Fidder H,Neufeld G,Klagsbrun M.Characterization of novel vascular endothelial growth factor (VEGF) receptors on tumor cells that bind VEGF165 via its exon7-encoded Domain.J Biol Chem,1996;271:5761-5767

　　［3］Zhang XJ,Li J,Zhang BY,Hong T.High-level expression and characterization of the fusion protein consisting of diphtheria toxin and human interleukin6.Shengwu Huaxue Yu Shengwu Wuli Xuebao,1998;30:169-173

　　［4］Arora N, Masood R,Zheng T, Cai J,Smith DL,Gill PS.Vascular endothelial growth factor chimeric Toxin is highly active against endothelial cells.Cancer res,1999;59:183-188

　　［5］Ramakrishnan S,Olson TA,Bautch VL,Mohanraj D.Vascular endothelial growth factor-toxin conjugate specifically inhibits KDR/flk-1-positive endothelial cell prolieration in vitro and angiogenesis in vivo.Cancer Res,1996;56:1324-1330

收稿日期：2000-01-03