陕西人群Rb1.20位点的VNTR多态性与食管癌遗传易感性相关

　　第四军医大学学报2000年第21卷第2期

秦鸿雁　舒青　刘素英　马群风

　　摘　要：目的　探讨陕西人群Rb1.20位点VNTR多态性是否与食管癌遗传易感性有关.方法　应用PCR方法对陕西正常个体外周血（50例）、食管癌组织（36例）、食管癌癌旁组织（27例）Rb基因20内含子VNTR区进行了检测.结果　 共检出5个等位基因片段：385 bp（A），370 bp（B），355 bp（C），330 bp（D）和325 bp（E）. 在正常人群中，其等位基因频率分别为：A 0.31，B 0.15，C 0.07，D 0.05，E 0.42，杂合性为72%，PIC为0.70；在食管癌癌组织中，其等位基因频率分别为：A0.15，B 0.17，C 0.17，D 0.36和E 0.15，PIC为0.77；在食管癌癌旁组织中，其等位基因频率分别为：A0.11，B 0.30，C 0.11，D 0.43和E 0.06，杂合性为22%，PIC 为0.70. Rb1.20位点VNTR多态性在不同群体中有显著差异.结论　 推测 Rb1.20位点的VNTR多态性与食管癌遗传易感性有关.

　　关键词:重复序列,核酸；聚合酶链反应；食管癌；易感性

　　0　引言

　　数目可变串联重复序列（variable number of tandem repeat, VNTR ) 是人类基因组中近年来常用的一种多态标记, 其应用十分广泛^［1］. Rb1.20位点位于13q14，为Rb基因20 内含子VNTR区，重复单位4 bp～5 bp，重复次数10～26次，是一理想的遗传标记^［2］.食管癌是我国常见的恶性肿瘤，具高发区和家族聚集现象，陕西也是该疾病的高发区之一.有关食管癌的Rb基因研究报道已有不少，但有关Rb基因的VNTR多态性与食管癌的遗传易感性的研究目前尚未见报道.为此，我们应用PCR-VNTR技术对陕西人群Rb1.20位点VNTR多态性进行检测并探讨了Rb1.20位点VNTR多态性与食管癌遗传易感性之间的关系.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　陕西地区正常人群外周血样50例，由西京医院血库提供.食管癌（鳞癌）组织 36 例及癌旁组织27例，取自唐都医院胸外科手术标本，经病理组织切片确诊.

　　1.2　方法　常规酚/氯仿法提取外周血白细胞DNA和癌组织及癌旁组织DNA. pCR反应总体积为30 μL，含基因组DNA 0.5 μg，dNTP100 μmol^．L^-1，1×PCR缓冲液（10 mmol^．L^-1 Tris-HCl, 50 mmol^．L^-1 kCl，pH 9.0，1 g^．L^-1 Triton-100，1.5 mmol^．L^-1 MgCl₂，0.1 g^．L^-1 gelatin），引物浓度各为100 μmol^．L^-1.引物序列为5′-AATTAACAAGGTGTGGTGGT-3′及5′-AAGTAAGAAAATCAAGCACTT-3′（美联公司合成）.经 97℃变性10 min后，在94℃加入Taq DNA聚合酶2^．5 u（上海Promega公司），加30 μL石蜡油覆盖，然后进入循环. rb1.20扩增的反应条件为：94℃变性30 s，52℃复性30 s，72℃延伸1 min，30个周期循环后，72℃延伸10 min（PCR仪为PE公司480型）.扩增产物以Marker（上海复华公司）为对照，80 g^．L^-1普通聚丙烯酰胺凝胶电泳后，溴化乙锭染色，观察结果.

　　2　结果

　　陕西地区正常人群外周血50例遗传上无关个体基因组DNA经PCR扩增后，检测出385，370，355，330和325 bp 5个等位基因片段（Fig 1），其频率分别为： 0.31， 0.15，0.07，0.05及0.42，杂合子频率为72%（Tab1）. 根据检测结果计算得其多态信息量（polymorphism information contents，PIC）为0.70.

图 1　Rb1.20位点VNTR等位基因片段（5个)

　　fig 1　Five allele fragments of Rb1.20 locus VNTR

表 1　陕西地区正常人群Rb1.20位点VNTR的多态分布

　　tab 1　Polymorphism distribution of Rb1.20 VNTR

　　in normal population in Shaanxi area

　　食管癌患者36例癌组织DNA经PCR扩增后，获得与正常人相同的5个等位基因片段；26例癌旁组织DNA经PCR扩增后，同样也得到与正常人相同的5个等位基因片段，其各自的等位基因频率(Tab2）. 其中癌旁组织的等位基因杂合子的频率为22%. PIC值为0.70，而癌组织的PIC值为0.770，将正常人群与食管癌患者的 rb1.20位点的各等位基因片段频率进行比较. 经χ²检验，发现它们除了370 bp 处差异无显著性外，其余4个等位基因片段处差异都呈显著性.将正常人群与食管癌癌旁组织Rb1.20位点的各等位基因片段频率进行比较，经χ²检验，除355 bp处差异无显著性外，其余各片段差异呈显著性.同样将食管癌与癌旁正常组织Rb1.20位点的各等位基因片段频率进行比较，经χ²检验，5个等位基因片段处无显著差异.等位基因片段可纯合存在，也可杂合存在.将正常人群与食管癌癌旁组织等位基因杂合子频率进行比较，经χ²检验，P＜0.01.

表 2　食管癌与癌旁组织Rb1.20位点VNTR多态分布

　　tab 2　Polymorphism distribution of Rb1.20 VNTR in esophageal cancer

　　and pericancerous non-tumor tissue

　　E=esophageal cancer tissue; E+=pericancerous non-tumor tissue. 3　讨论

　　Rb基因是目前研究较为广泛的抗癌基因，具生长负调节作用，位于13q14，其作用的丧失与多种肿瘤的形成和发展密切相关^［3］.李华川等^［4］首次在食管癌及癌旁组织中发现有34.9%和33.3%的Rb基因异常，又首次证明了环境化学致癌物质如亚硝胺能使Rb基因丢失，从而推测Rb基因异常在食管癌发生发展中可能起重要作用. vNTR是人类基因组内一种有高度多态性的遗传标记，可供信息量高，Yandell等^［2］于Rb基因外显子20附近的内含子中发现一VNTR位点，将其命名为Rb1.20.我们从食管癌遗传易感性可否由VNTR多态性而改变这一角度出发，来探索食管癌的发生发展机制.

　　Rb1.20位点的VNTR具10～24个等位片段，核心序列为〔CTTT（T）〕n，n=14～26^［2］.我们对陕西地区人群Rb1.20位点VNTR的多态性进行检测，共检出5个等位基因片段,表明该位点呈高度多态.后根据等位基因频率计算得出该多态位点的PIC值在0.70以上，表明该位点可提供信息量较高.陕西地区人群Rb1.20位点VNTR多态性是否与食管癌遗传易感性有关，我们将正常人群与食管癌患者两者的Rb1.20位点VNTR多态性进行比较，发现正常人群与食管癌组织及癌旁组织在该位点VNTR多态性有显著差异，但将食管癌与癌旁组织两者在该位点VNTR多态性进行比较后，却发现两者在各等位片段处无显著性差异，这说明该位点VNTR多态性可能与食管癌的发展关系不太密切.据此， 我们推测正常 人群与食管癌患者在Rb1.20位点VNTR多态性的改变可能造成食管癌患者易感.另外，为进一步验证此观点，我们又将正常人群和食管癌癌旁组织两者的Rb1.20位点等位基因杂合子频率进行了比较，同样发现它们差异显著.结果表明：陕西地区人群Rb1.20位点VNTR多态性的改变可能与食管癌遗传易感性有关.

　　Rb基因除了Rb1.20位点含VNTR多态位点外，还在P68RS2.0位点及内含子16等处含多态位点^［5,6］.我们仅从Rb基因的一个VNTR多态位点探讨了其与食管癌遗传易感性的关系，为了将来更好地探讨Rb基因多态性与食管癌遗传易感性关系，以期从Rb基因多态性角度探讨食管癌的发生发展机制，Rb基因其他多态位点的研究工作还有待进一步研究.

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600126)

　　作者简介：秦鸿雁(1971-)，女(汉族)，河南省武陟人.硕士， 讲师，发表论文6篇. Tel.（029）3374490　Email. swxayz@fmmu.edu.cn秦鸿雁（第四军医大学基础部生物学教研室,陕西 西安 710033）　舒青（第四军医大学基础部生物学教研室, 陕西 西安 710033）　刘素英（第四军医大学基础部生物学教研室, 陕西 西安 710033)

　　马群风（第四军医大学唐都医院胸外科）

　　参考文献：

　　［1］Nakamura Y，Leppert m，O′Connell P et al. Variable number of tandem repeat(VNTR) markers for human gene mapping［J］. Science, 1987; 235(4796):1616-1622.

　　［2］Yandell DW，Oryja TP. Detection of dna sequence polymorphism by enzymatic ampliication and direct genomic sequencing［J］. Am J Hum Genet,1989; 45(4):547-555.

　　［3］Weinberg RA. Oncogenes,antioncogenes and the molecular　bases of multistep carciogenesis［J］. Cancer Res, 1989; 49(14):3713-3721.

　　［4］李华川，陆士新，姜　伟 et al. 食管癌组织中抗癌基因Rb的研究［J］.中华肿瘤杂志，1990;12（3）：161-164.

　　［5］Wiggs J，Nordenskjold M，Yandell DW et al. Prediction of the risk of hereditary retinoblastoma，using DNA polymorphims with the retinoblastoma gene［J］. new Engl J Med,1988；318(1):151-157.

　　［6］袁丽芳，高永庆，罗　双 et al. 应用Rb基因内多态位点作家系连锁分析预测视网膜母细胞瘤［J］.中国医学科学院学报，1995;17（5）：338-341.