双歧杆菌对实验性大肠癌PCNA和bcl-2表达的影响

　　中国微生态学杂志2000年第12卷第2期

王立生　潘令嘉　郑跃杰　孙勇　张亚历　周殿元

　　 摘要　目的：观察青春型双歧杆菌对大肠癌移植瘤增殖细胞核抗原(PCNA)和bcl-2基因蛋白表达水平的影响。方法：以大肠癌裸鼠移植瘤为动物模型，用免疫组化法。结果：显示双歧杆菌注射组大肠癌移植瘤PCNA阳性细胞密度以及bcl-2蛋白表达率、表达强度、阳性细胞密度均显著低于肿瘤对照组(P＜0.01)。结论：青春型双歧杆菌能明显降低大肠癌移植瘤的增殖活性，同时使其bcl－2基因的表达下调。

　　 关键词：双歧杆菌　大肠癌　免疫组化法

　　双歧杆菌是机体肠道内最主要的生理性细菌。它在体内能抑制多种肿瘤的生长，如Meth a 纤维肉瘤、黑色素瘤、乳腺癌和肝癌等^［1］。我们的资料也表明青春型双歧杆菌对大肠癌裸鼠移植瘤的生长具有明显的阻抑作用。其抑瘤机制之一是诱导大肠癌移植瘤细胞发生凋亡^［2］。由于细胞凋亡是在基因的调控下发生的，为此本文以免疫组化法检测了大肠癌裸鼠移植瘤细胞增殖细胞核抗原(Proliferating cell Nuclear Antigen, PCNA)和bcl-2的表达水平，旨在进一步探讨青春型双歧杆菌的抑瘤机制。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验动物　BALB/c(nu/nu),雄性，6周龄～8周龄，体重约18g～22g，购于本校实验动物中心，饲养于SPF级动物室。

　　1.2　菌种来源及其培养　双歧杆菌系本所从健康婴儿粪便中分离培养所得，经API-20A及TAB系统(英国)和多次生化反应鉴定为青春型。实验时将双歧杆菌接种至硫乙醇酸盐肉汤中，置厌氧培养箱37℃培养72h，含菌培养液3000rpm离心10min，去上清，沉渣以PBS液洗3次，调细菌数为1×10¹⁰/ml。

　　1.3　大肠癌细胞株　Lovo细胞株为人未分化结肠癌细胞，引自本校病理教研室。按常规传代于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，生长至单层后，以0.25%胰蛋白酶消化贴壁的细胞，调细胞数为1×10⁷/ml。

　　1.4　大肠癌裸鼠移植瘤模型的建立及双歧杆菌的处理措施　动物分为两组，(1)肿瘤对照组：20只裸鼠，实验的第1天于裸鼠的左前肢背部皮下接种Lovo细胞2×10⁶(0.2ml)，第2天起于其腹腔注射PBS液0.2ml，每天一次，连续5天；(2)双歧杆菌注射组：20只裸鼠，实验第1天接种Lovo细胞的数量、部位及程序均同肿瘤对照组，第2天起向裸鼠腹腔注射双歧杆菌2×10⁹个(0.2ml)，每天一次，连续5天。于实验的第21天处死动物，剥离瘤体，将新鲜肿瘤组织固定于10%中性福尔马林溶液中，常规石蜡包埋，制片，行HE染色，组织学证实为未分化结肠癌。

　　1.5　免疫组化染色　染色程序按免疫组化SP法常规进行。鼠抗人PCNA单抗、鼠抗人bcl-2单抗、生物素化马抗鼠IgG以及SP试剂盒均为美国Santa cruz公司产品。以PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.6　观察指标及统计学处理　PCNA、bcl-2蛋白染色阳性切片分别以16D目镜测微网在400倍放大下计数网格中的阳性细胞数，每例计数10个网格，取其均值作为阳性细胞密度，以t检验行统计学处理。bcl-2蛋白表达强度依其阳性产物着色深度分为4级：阴性(-)，弱阳性(+)，中等阳性(x)，强阳性(x)，，两组之间蛋白表达强度的比较采用秩和检验进行统计学处理。

　　2　结　果

　　2.1　大肠癌裸鼠移植瘤PCNA的表达情况　PCNA阳性细胞核呈棕黄色，不弥散于胞浆，背景清晰。肿瘤对照组大肠癌移植瘤PCNA阳性细胞呈弥漫分布，其数量显著多于双歧杆菌注射组(P＜0.01)，具体见表1。

表1　大肠癌裸鼠移植瘤中PCNA及bcl-2阳性细胞密度(个，x±S)

　　 注：和双歧杆菌注射组相比，^△P＜0.01，^*P＜0.01

　　2.2　大肠癌裸鼠移植瘤bcl-2基因的蛋白表达情况　bcl-2基因的蛋白阳性表达产物均位于胞浆，尤以核周明显，阳性细胞呈弥漫分布。双歧杆菌注射组移植瘤bcl-2基因的阳性表达率为70%，多为弱阳性表达；肿瘤对照组bcl-2基因的表达率为90%，主要以中等及强阳性表达为主。肿瘤对照组的bcl-2阳性细胞密度显著高于双歧杆菌注射组(P＜0.01)，具体见表2。

表2　大肠癌裸鼠移植瘤中bcl-2蛋白的表达强度和表达率

　　 注：和肿瘤对照组相比，^*P＜0.01,^**P＜0.01

　　3　讨　论

　　细胞过度增殖以及凋亡受抑是许多肿瘤发生与发展的基础。PCNA是DNA聚合酶的辅因子，主要表达于细胞增殖周期的S期，为DNA复制和合成所必需，因此它的表达程度可以反映细胞增殖活性，据此可用于判断肿瘤细胞的生长速度^［3］。本文结果中，双歧杆菌注射组大肠癌裸鼠移植瘤细胞的PCNA阳性细胞密度显著低于肿瘤对照组，提示青春型双歧杆菌能降低大肠癌移植瘤细胞的增殖活性，使之生长减慢。

　　细胞凋亡是在一定的条件下启动自身的内部调控机制而发生的一种细胞的主动死亡方式。已知bcl-2是重要的凋亡调控基因。它能拮抗bax基因的促凋亡作用，抑制细胞色素C从线粒体释放至胞浆，改变核内的氧化还原反应，降低caspase蛋白酶的活性，最终抑制细胞凋亡^［4］。目前已证实bcl-2基因能抑制激素、生长因子、放射线、化疗药物以及病毒等多种因素诱导的细胞凋亡。本文结果中，荷瘤鼠经双歧杆菌处理后，其大肠癌移植瘤bcl-基因的表达率、表达强度以及阳性细胞密度均明显低于肿瘤对照组，提示青春型双歧杆菌能使大肠癌移植瘤细胞bcl-2基因的表达下调。

　　双歧杆菌在体内具有生物学屏障、控制内毒素血症、免疫赋活以及延缓衰老等多种重要生理功能。此外它还具有抗肿瘤作用。Sekine等发现婴儿型双歧杆菌的完整肽聚糖(whole peptidoglycan, WPG)对小鼠皮下移植的Meth A纤维肉瘤的生长具有明显的阻抑作用^［1］。我们也证实青春型双歧杆菌能通过诱导细胞凋亡的途径来抑制大肠癌裸鼠移植瘤的生长^［2］。目前多数学者认为双歧杆菌的抑瘤机制主要是通过激活机体免疫系统中的巨噬细胞和NK细胞，使之分泌多量的具有杀瘤活性的IL-1、IL-6、IL-12以及NO等^［5，6］。结合本文实验结果，我们认为双歧杆菌的另一抑瘤途径是降低肿瘤细胞的增殖活性，并能抑制其bcl-2基因的表达，诱导肿瘤细胞发生凋亡。

　　作者简介：王立生(1968-)，男，主治医师，博士，研究方向为双歧杆菌的抗肿瘤作用及其机制。

　　作者单位：王立生（第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广东 广州　510515)

　　 　潘令嘉（第一军医大学 南方医院全军消化内科研究所，广东广州　510515)

　　 　郑跃杰（第一军医大学 南方医院全军消化内科研究所，广东广州　510515)

　　 　孙　勇（第一军医大学 南方医院全军消化内科研究所，广东广州　510515)

　　 　张亚历（第一军医大学 南方医院全军消化内科研究所，广东广州　510515)

　　 　周殿元（第一军医大学 南方医院全军消化内科研究所，广东广州　510515）

　　参考文献

　　［1］SEKINE K, OHTA J, oHNISHI M, et al. Significance of bacterial structure of WPG related to antitumoral activity ［J］. Biotherapy, 1990,6:329-335.

　　［2］王立生，潘令嘉，郑跃杰，等.双歧杆菌诱发实验性大肠癌凋亡的电镜观察［J］.中国微生态学杂志，1998，10：193-195.

　　［3］HALL PA ， LEVISON DA. Assessment of cell proliferation in histological material ［J］. J Clin Pathol, 1990,43:184-197.

　　［4］WILLIAMS GT. Programmed cell death: apoptosis and oncogenesis ［J］. cell, 1995,65:1097-1098.

　　［5］王立生，潘令嘉，郑跃杰，等.双歧杆菌对裸鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1以及IL-2的影响［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，1998，5：214-216.

　　［6］王立生，潘令嘉，郑跃杰，等.双歧杆菌对裸鼠腹腔巨噬细胞NO形成的调节作用［J］.中国微生态学杂志，1998，10：321-323.