多药耐药基因在进展期大肠癌中检测及意义

世界华人消化杂志 1999年第6期第7卷 文献综述

作者：姚学清　卿三华

单位：第一军医大学南方医院普外科　广东省广州市　510515

关键词：结、直肠肿瘤；多药耐药基因；基因表达

　　中国图书馆分类号　R735.34

　　Subject headings　colorectal neoplasms; multidrug resistance gene; gene expression

　　大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在消化道较高.进展期大肠癌根治性效果差，手术切除率只有50%左右，大部分进展期大肠癌术后发生腹腔内复发转移，5a生存率只有23%～30%.近年腹腔热灌注化疗^［1-3］引起国内外学者广泛的关注，对术后腹腔内复发转移的防治具有一定的作用，但多药耐药(Multidrug resistance, MDR)是大肠癌化疗失败的主要原因之一本文对进展期大肠癌MDR检测及临床意义进行综述.

　　1　大肠癌癌变过程

　　在大肠癌的形成过程可划分三个阶段^［4］，第一阶段是小的良性类型腺瘤或息肉，在人体的大肠中常发生，大多情况下不会发展成癌，但少数情况下腺瘤增大，而且有较多的绒毛，发展到第二阶段，此时的肠上皮细胞生长活跃，开始形成癌灶，进一步发展成第三阶段浸润癌，此时的癌组织团较大(＞1cm³)，具有丰富的绒毛，Ki-ras基因点的突变率达50%左右，肿瘤扩展到腹腔微小病灶的转移逐步发展成中晚期大肠癌.

　　在家族性腺瘤样息肉病(FAP)的腺瘤中，分离出FAP基因，它定位于人染色体5号，其丢失率约为35%.大肠癌的癌变过程包括多个癌基因的激活和多个癌抑制基因的丢失^［5］.大肠癌癌变是多种基因及产物的蓄积性变化，不一定与其变化先后有关^［6］.目前大多学者同意大肠癌变的模如图1^［4］.

　　2　MDR在大肠癌中的表达及检测

　　2.1　MDR和Pgp MDR是肿瘤细胞在接触了一种抗癌药物后产生对其他多种结构与功能迥异的天然抗癌药物的耐药^［5-7］，MDR是大肠癌化疗中主要障碍之一，与之相关的是Pgp(P-plycoprotein).在Pgp方面的研究逐渐增多，Pgp作为一种独立的能量流出泵(也称ATP流出泵)，它来自肿瘤细胞，可使化疗药物效性的降低. mDRI(multidrug resistance gene)及其产物Pgp能够将药物从细胞中泵出，减少了抗肿瘤药物在细胞中的聚集，从而减少了药物的效性.在MDR方面，MDR1 mRNA和Pgp可能是一重要目标. Stein et al^［9］研究发现，人TNF和IL-2在MCT15和MCT116人结肠癌细胞转导和表达，可以逆转MDR. tNF和IL-2部分减少mRNA和Pgp水平上MDR1表达(P＜0.243).几种接近的方法可以影响Pgp的活性，应用钙通道阻断剂、钙调蛋白等或应用各种细胞分裂调节MDR1基因表达，并且MDR基因表达应视作先天性表达，说明了MDR1基因的表达大部分贯穿于大肠癌中，这对大肠癌化疗成败起着关键作用.人类MDR家族是由MDR1和MDR3组成，并相应地编码了各自的Pgp.转基因试验表明，MDR3与肿瘤的耐药相关不大，MDR1起主要作用，它能抵抗若干在结构和功能上并不相关的亲脂类药物^［9］.

　　2.2　多药耐药基因　(MDR1)和多药耐药相关蛋白(MRP)Gottesman et al^［10］1987年提出，临床晚期结肠癌化疗重要障碍是MDR，MDR是引起MDR1表达的一部分，MDR1编码为Pgp(P-170)，他们认为是一种能量依赖流出泵，这种观点被大多学者所接受.有关MDR1基因及其表现型的研究已基本清楚，MDR1基因的克隆及基因表达已用于临床，根据MDR发生机制，可以采取以下几种方法来逆转：①应用钙道抑制剂，使肿瘤细胞内的化疗药物聚集增加，从而增加了抗癌药的效性.②应用单克隆抗体选择性抑制MDR细胞生长，减少肿瘤细胞的MDR.③应用MDR细胞对某些药物和环境改变的高度敏感性使MDR逆转.逆转剂的发现为逆转药物的研究提供了一定的理论根据，同时解决了一些实际问题. weinstein et al^［11］认为65%～68%大肠癌最初是由MDR1 mRNA和Pgp表达的.最近有关报道，MRP过度表达机制可能是非Pgp介导产生的，这种Mr190000的膜蛋白是被MRP编码完成. fitpits et al^［12］认为首先是解决MRP在大肠的表达，从而解决MRP耐药机制，克服大肠癌化疗中MRP具有重要参考价值.其次评估MRP作为其他临床参数，包括患者的存活率. Versantvoort et al^［13］认为MRP引起MDR有两种模式.第一种模式认为，MRP是具有运转谷胱甘肽-S-偶合物和细胞毒性药物的双重作用，药物运转的调节与谷胱甘肽-S-偶合物运转的调节是密切相关的.第二种模式认为，MRP是一种谷胱甘肽-S-偶合物运载体，能够活化内源性潜在药物的运转蛋白，细胞毒性药物由细胞内的潜在药物转运蛋白转运，而MRP能与之形成膜相关复合物，MRP对谷胱甘肽-S-偶合物的运转将同样引起药物的一系列变化.总之MRP在某些实体瘤中已被证实作为另一种MRP基因可能参与替代MDR机制^［14］.

　　2.3　MDR的检测　MDR是大肠癌化疗的一个主要障碍，我们必须采用各种对Pgp, mRP等进行检测，在临床及基础研究中关系到肿瘤治疗的成败，可以预测肿瘤耐药的产生，又可估计肿瘤的生物学特性，从而衡量其预后的指标. vitols et al^［15］发现大肠癌的LDL受体基因表达通常高于正常结肠粘膜，而HMG-COA还原酶的基因表达在二组织中是相似的.应用一种敏感的试验方法，发现大肠癌MDR1 mRNA水平低于正常结肠组织.实验表明，同一类型肿瘤分化程度不同，其MDR1的表达量也不相同，分化好的肿瘤MDR1表达量明显高于分化差或分化中等的肿瘤，对化疗不敏感相一致.大肠癌组织MDR1基因低水平表达提示在肿瘤组织中MDR不会被Pgp介导药运送引起.早期大肠癌标本，MRP mRNA表达是由RT-PCR检测，药物灵敏的T耐药细胞作为各自的阴阳性控制而被应用的. filipit et al研究中，88%大肠癌可以表达MRP mRNA，13例大肠癌患者是阴性的MRP mRNA，并且保持阴性到RT-PCR由30～50循环时.

　　Vitols et al认为蛋白水平的MRP表达被单克隆抗体的免疫组化所检测，QCRL-1，QCRL-3在结肠癌冻结的部分，也在正常组织附近；免疫组化方法分析总例数在105例，除30例结肠标本被RT-PCR检测，着色阳性的调节细胞株T5在临床标本是强阳性的，用抗-MRP抗体着色强阳性占23%，弱阳性占77%，完全的染色阴性的MRP在大肠癌标本中难以见到.另外，在一些结肠标本中可以用MRP表达评估正常组织.为了评估MRP和MDR1的关系，比较二者的基因，MRP基因由RT-PCR检出，且检出率占83%，Pgp表达应用免疫组化方法由单克隆抗体C219和MRK16检测，发现肿瘤标本中40%和47%阳性，可以看出MRP和MDR1 mRNA或者Pgp之间没有重大的联系. 在目前的研究中，88%的初期结肠癌可以由MRPmRNA表达查出.目前，已制备了许多检测MDR的特异性单克隆抗体，比如识别Pgp的单抗MRK16、MRK17，识别MRP的单克隆MRPr1、MRPm1等等.

　　3　MDR的临床意义

　　MDR产生的主要原因是过度表达的Pgp使大肠癌细胞内药物外流增加，故任何降低其外流的物质可使细胞内药物聚集增加，从而有效杀伤大肠癌细胞^［6］.应用灵敏的试验方法，Vitols发现大肠癌MDR1 RNA表达水平低于正常组织，其他显示肾脏附近组织和肾脏具有较高的MDR1mRNA表达水平，而在肺脏、肝脏、空肠和结肠是中间表达水平，其他组织是低表达水平^［16］.在肾脏附近、肾脏、肝脏和结肠肿瘤中有较高标准的MDR₁mRNA^［17］，MDR₁基因过度表达是产生MDR的主要原因. walther et al^［18］研究发现TNF和IL-2可以调节MDR1表达和增加某一MDR1药物在肿瘤细胞系毒性.

　　3.1　RT/PCR应用　RT/PCR具有操作简单，特异性强的特点. mDR的表达水平与肿瘤细胞对化疗药物的耐受性相关，RT/PCR为临床提供了一个观察MDR1基因是否表达的手段，如何指导临床医生选择合理的化疗方案，对于P-170是否可作为大肠癌临床治疗监测的一个有用指标，与大肠癌对化疗反应的直接关系及MDR的逆转，还待进一步的研究.

　　3.2　MDR临床价值　决定大肠癌的患者MRP的临床价值，Filipits et al^［12］应用RT/PCR及免疫组化的方法研究了MRP表达、MRP表现型，观察了88%大肠癌标本，单克隆抗体QCRL-1和QCRL-3在所有标本中占23%强阳性，77%弱阳性，对于年龄及性别无明显差别.早期结肠癌中瘤体大小、级别及远处淋巴结转移，强阳性的MRP表达与MDR1 rNA或Pgp蛋白无关，与临床大肠癌存活率有明显的差异. 辩认MDR生物学机制可以改善临床大肠癌治疗^［19］，美国癌症防治研究所应用60株细胞株作为新的因子，以PCR技术设计MDR1/Pgp的表达，在39株细胞中检出MDR表达基准，尤其在肾癌和结肠癌有很高表达水平.一般来说，由Pgp含量较高的组织发生肿瘤，其MDR1/Pgp表达水平也较高，而未经治疗的肺癌、乳癌、食管磷癌等Pgp表达阴性，说明由MDR1过度表达组织癌变时，其MDR1基因也表达^［20］.在大肠癌的治疗过程中，MDR给临床化疗带来许多困难，国内外学者对MDR作了大量的研究工作，近年来，由于使用了更有效的化疗药物，同时制订了更完备的联合化疗方案，使大肠癌患者化疗的疗效得到了稳定的提高，在临床很多患者经过最初的化疗后，最终产生MDR，从而使临床化疗失败，但如何解决MDR方面的诸多问题，还处于探索阶段.

　　MDR是耐药的重要形式，大肠癌的MDR是一种复杂现象，可能包括MRP基因和MDR1基因，MDR是大肠癌化疗失败的主要原因，MDR的表达水平与大肠癌细胞对化疗药物的耐受性相关，所以，通过对MDR的发生机制的研究，以反映大肠癌患者对药物敏感程度，以指导临床医生选择合理的化疗方案. mDR作为一种Pgp过度表达，是临床医生在大肠癌的化疗遇到的技术难关.

　　通讯作者　姚学清

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收稿日期　1999-02-05　修回日期　1999-04-12