TGFα，EGFR反义寡聚核苷酸抑制人大肠癌细胞的增殖

世界华人消化杂志 1999年第6期第7卷 研究原著

作者：王述民　吴金生　要　秀　何泽生　潘伯荣

单位：王述民　　潘伯荣　　第四军医大学唐都医院1胸外科； 吴金生　要　秀　何泽生　　普通外科　陕西省西安市　710038

关键词：寡聚核苷酸；转化生长因子α；表皮生长因子受体；结直肠肿瘤

　　摘　要

　　目的　研究TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸抑制大肠癌HR8348细胞株恶性增殖的作用.

　　方法　采用23个碱基组成的TGF_α反义寡聚核苷酸和21个碱基组成的EGFR反义寡聚核苷酸以及21个碱基组成的对照寡聚核苷酸作用于人大肠癌HR8348细胞，通过细胞生长抑制实验，³H-TdR掺入，mRNA斑点杂交及细胞周期分析以确定其对大肠癌细胞的增殖抑制作用和作用环节.

　　结果　TGFα，EGFR反义寡聚核苷酸与对照寡聚核苷酸相比较，均能有效抑制HR8348细胞的增殖(P＜0.01)，DNA合成(P＜0.01)和mRNA(P＜0.01)的表达，并能有效地延缓HR8348细胞由G₀/G₁期向S期的转化，延缓了细胞的分裂增殖.

　　结论　TGFα，EGFR反义寡聚核苷酸均能有效地抑制HR8348细胞的恶性增殖.

　　中国图书馆分类号　R735.34

Effect of TGF_α, eGFR anti-sense oligodeoxynucleotides on colon cancer cell line

WANG Shu-Min¹, WU Jin-Sheng², yAO Xiu², HE Ze-Sheng²,and PAN Bo-Rong³¹Department of Thoracic Surgery and ²Department of General Surgery, Tangdu Hospital, FourthMilitary Medical University, Xi'an 710038,Shaanxi Province, China³Room 12, Building 621, FourthMilitary Medical University, Xi'an 710033,Shaanxi Province China

　　Subject headings　oligodeoxynucleotides;

　　transforming growth factor-α; epidemal growth factor receptor; colorector neoplasms

　　Abstract

　　aIM　To study the inhibitory effect of transforming growth factor-alpha(TGF_α), epidemal growth factor receptor(EGFR) anti-sense oligodeoxynucleotides on the malignant proliferation of the HR8348 cell line .

　　mETHODS　TGFα, eGFR anti-sense oligodeoxynucleotides, composed of 23 and 21 bases, respectively, and indifferent oligodeoxynucleotides were used to affect the HR8348 cells. The cell growth inhibition, ³H-TdR incorporation,mRNA hybridization and the cell cycle analyses were made to identify the inhibitory effect and mechanism of TGFα, eGFR anti-sense oligodeoxynucleotides.

　　rESULTS　TGFα, EGFR anti-sense oligodeoxynucleotides both could inhibit the proliferation of HR8348 cell; the DNA synthesis; the mRNA expression; and delay the transition period of g₀/G₁ phase to S phase.

　　cONCLUSION　TGFα, eGFR anti-sense oligodeoxynucleotides both could inhibit the malignant proliferation of the HR8348 cell effectively.

　　0　引言

　　转化生长因子α(transforming growth factor α，TGF_α)与癌瘤细胞的关系十分密切，在人的多种肿瘤组织、癌细胞及转化细胞如延腺癌细胞^［1］、放射线转化细胞^［2］、膀胱癌细胞^［4］、肝癌细胞^［5］及大肠癌细胞^［6］均发现有TGF_α的高表达. tGF_α的最主要的生物学功能是促进细胞转化，引起细胞分裂增殖^［7］，在癌瘤的发生及发展中起重要作用.而在人的多种肿瘤组织、癌细胞如乳腺癌^［8］、食管癌、头颈部鳞癌^［9］、卵巢癌^［10］及大肠癌^［11］均有表皮生长因子受体(epidermal growth factor recptor, EGFR)的高表达，多数文献报道：肿瘤细胞EGFR表达增高主要在转录水平，且EGFR的过度表达能够促进肿瘤细胞的生长及局部浸润并增强转移趋势. hR8348细胞株是我国以人直肠低分化管状腺癌组织体外传代建立，能在体外长期传代培养，经各项鉴定表明有恶性细胞特性^［12］.我们以HR8348细胞株为研究对象，人工合成23个碱基组成的TGF_α反义寡聚核苷酸和21个碱基组成的EGFR反义寡聚核苷酸以及21个碱基组成的对照寡聚核苷酸，研究TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸对细胞增殖、DNA合成及mRNA表达的影响，并做了细胞周期分析，旨在进一步揭示TGF_α，EGFR在HR8348细胞增殖中的作用，为肿瘤基因治疗提供实验依据.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　TGF_α， EGFR cDNA探针由上海生化所提供；³H-TdR为上海原子核研究所产品；RPMI1640为GIBCO产品；小牛血清为杭州四季青生物工程材料研究所产品. tGF_α反义寡聚核苷酸与TGF_α cDNA^［13］前6个密码子及其上游部位共23个碱基互补，序列为：5＇-TCCAGCCGAGGGGACCATTTTAG-3＇，EGFR反义寡聚核苷酸与EGFRcDNA^［14］的上游部位(包括起始密码)21个碱基互补，序列为：5＇—CGTCCCGGAGGGTCGCATCGC—3＇，均用硫代磷酸修饰；对照寡聚核苷酸的序列经计算机检索与TGF_α，EGFR，cDNA均无互补性，序列为5：＇—GGCCTCGGATCCTGCGCA—3＇.

　　1.2　方法　①细胞培养：HR8348细胞株由本实验室液氮冻存，复苏后培养于含40mL/L小牛血清的RPMI1640培养液，小牛血清65℃，1h灭活.②细胞生长抑制实验：取指数期HR8348细胞，胎盘蓝染色计数，观察细胞生存率(大于95%)，然后在与细胞计数平行的96孔培养板中分别加入含2，4，8，16μmol/L的反义寡聚核苷酸和对照寡聚核苷酸的培养液，培养24，48，72h后进行胎盘蓝染色计数，以下式计算生长抑制率：(N_n-N)/N_n×100%，N为处理后细胞计数，N_n为未处理细胞计数.③³H-TdR掺入实验：按文献［15］方法进行. 抑制率=(未处理cpm值-实验组cpm值)/未处理cpm值×100%.④mRNA斑点杂交：按文献［16］方法进行. ⑤细胞周期分析：按文献［17］方法进行.

　　2　结果

　　2.1　TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸对HR8348细胞增殖的抑制作用　2，4，8，16μmol/L的TGF_α反义寡聚核苷酸对HR8348细胞生长的抑制率分别为21.7%，31.7%，38.7%，48.3%，而EGFR反义寡聚核苷酸对HR8348细胞生长的抑制率分别为15.0%，25.0%，33.3%，43.3%，两者抑制作用均随浓度升高而增强；而相同浓度的对照寡聚核苷酸对HR8348细胞的抑制率仅为5%，6.6%，10%，16.6%，较TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸的抑制作用明显减弱(P＜0.01)，但TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸两组间却无明显差异(P＞0.05)，且无剂效关系，说明TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸对HR8348细胞的作用均具有一定的特异性(图1).16μmol/L的TGF_α反义寡聚核苷酸对HR8348细胞的抑制率在12，24，48，72h分别为28.8%，41%，48.3%，25.4%，相同浓度的EGFR反义寡聚核苷酸的抑制率为31.4%，38.5%，43.3%，2.8%，而对照寡聚核苷酸为11.4%，12.8%，16.6%，8.5%，表明寡聚核苷酸对HR8348细胞的作用与时间有关，时间过分延长，抑制作用逐渐减弱(图2).

　　2.2　TGF_α，EGFR 反义寡聚核苷酸对HR8348细胞DNA合成的抑制作用　16μmol/L寡聚核苷酸对HR8348细胞的³H-TdR的掺入结果为TGF_α反义寡聚核苷酸作用于HR8348细胞48h对³H-TdR掺入的抑制率为46.9%，EGFR反义寡聚核苷酸的抑制率为37.7%，与对照寡聚核苷酸的抑制率7.2%相比均有显著差异(P＜0.01)，表明TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸均能有效地抑制HR8348细胞的DNA合成(图3).

图1　不同浓度的寡聚核苷酸作用48h对HR8348细胞生长的抑制.

图2　寡聚核苷酸16μmol/L在不同时间对HR8348细胞生长的抑制.

图3　寡聚核苷酸16μmol/L对HR8348细胞H-TdR掺入的抑制作用.

　　2.3　TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸对HR8348细胞TGF_α，EGFR mRNA表达的影响　16μmol/L的TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸和对照寡聚核苷酸分别作用48h，TGF_α，EGFR mRNA表达分别被抑制52.1%和47.9%，与对照组的22.9%和18.8%相比较均有显著差异(P＜0.01)，但TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸两组间却无明显差异(P＞0.05)，可见TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸对HR8348细胞中TGF_α，EGFR mRNA表达具有较强的抑制作用(表1，2).

表1　HR8348细胞中TGF_α mRNA斑点杂交扫描测量

表2　HR8348细胞EGFR mRNA斑点杂交扫描测量

　　2.4　TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸对HR8348细胞周期的影响　TGF_α， EGFR反义寡聚核苷酸作用HR8348细胞后G₀/G₁细胞数明显增多，S期细胞数减少，而G₂/M细胞数亦明显减少，提示：反义寡聚核苷酸可延长细胞由G₀/G₁期向S期的转化；PI较对照寡聚核苷酸组明显降低，提示细胞的分裂增殖受到抑制(表3).

表3　寡聚核苷酸16μmol/L作用48h HR8348细胞周期分析

　　3　讨论

　　我们采用了三条寡聚核苷酸链，第一条链与TGF_α cDNA转录起始区及前6个密码子互补，可在转录、复制水平抑制TGF_α的表达，可延缓HR8348细胞由G₀/G₁期向S期的转化；第二条链与EGFR cDNA起始部位互补，可在复制、转录水平抑制EGFR的表达，可延缓HR8348细胞由G₀/G₁期向S期的转化；而第三条链与TGF_α基因无互补性，为对照寡聚核苷酸，以衡量寡聚核苷酸对本实验体系的非特异性影响.在本实验中，TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸对HR8348细胞增殖的抑制作用与³H-TdR掺入及mRNA斑点杂交的结果基本一致，说明：TGFα，EGFR反义寡聚核苷酸均能有效地抑制HR8348细胞的增殖、DNA合成及mRNA的表达，其抑制作用随浓度升高而增强；相同条件下，对照寡聚核苷酸对HR-8348细胞的抑制作用明显降低，提示：TGF_α，EGFR反义寡聚核苷酸对HR-8348细胞的抑制作用均具有一定的特异性，但两组之间却无明显差异.且反义寡聚核苷酸对HR-8348细胞的抑制作用随时间的过分延长而减弱，据文献报道是寡聚核苷酸被细胞释放的核酸酶降解所致.

　　为进一步了解反义寡聚核苷酸对HR8348细胞抑制作用环节，我们应用流式细胞仪进行了细胞周期分析.结果提示：TGF_α， EGFR反义寡聚核苷酸均可有效地延缓HR8348细胞由G₀/G₁期向S期的转化，同时延缓了细胞的分裂增殖.我们进一步证实了TGF_α， EGFR在HR8348细胞增长中的重要作用及其反义寡聚核苷酸对HR8348细胞的有效的抑制作用，为进行动物实验及大肠癌的基因治疗提供了实验依据.作者简介:王述民，男，1966-08-29生，辽宁省大连市人，蒙古族.1991年第四军医大学本科毕业，1997年第四军医大学硕士，现攻读第四军医大学博士学位，主治医师，主要从事大肠癌的诊治研究，发表论文5篇.

　　通讯作者　王述民，710038，西安市新寺路第四军医大学附属唐都医院胸外科

　　Correspondence to:Dr. WANG Shu-Min, Department of Thoracic surgery, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, shaanxi Province, China

　　tel. +86·29·3510595 Ext. 77137(O)

　　4　参考文献

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收稿日期　1998-11-10　修回日期　1998-12-30