nm23-H1 基因杂合性缺失及突变与大肠癌转移抑制

中国普外基础与临床杂志 1999年第3期第6卷 基础与实验研究

作者：骆成玉　祝学光　李世拥　王申五

单位：骆成玉　李世拥　北京军区总医院普外科(北京　100700)；祝学光　王申五　北京医科大学人民医院

　　关键词： 大肠肿瘤；nm23-H1基因；杂合性缺失；基因突变

　　摘要　应用Southern印迹杂交和RT-PCR-SSCP银染、克隆及序列测定检测了36例大肠癌组织标本中nm23-H1杂合性缺失和突变情况。结果： 本组标本nm23-H1杂合性缺失率为29.63%，Duke’s D期及远处转移大肠癌有较高的杂合性缺失发生率； 大肠癌中未见nm23-H1基因突变。本实验结果提示： nm23-H1基因杂合性缺失可能参与大肠癌恶性进展及转移过程的调节，该基因突变在大肠癌中所起的作用可能较小。

THE RELATION OF THE LOSS OF HETEROZYGOSITY AND MUTATION FOR nm23-H1 WITH THE INHIBITION OF METASTASIS IN COLORECTAL CARCINOMA

Luo Chengyu, Zhu Xueguang, Li Shiyong, et al.

　　Department of General Surgery, Beijing Army General Hospital, Beijing 100700

　　Abstract　The loss of heterozygosity and mutation for nm23-H1 gene in colorectal carcinomas were studied by Southern blot and RT-PCR-SSCP/silver staining sequencing. The rate of loss of heterozygosity for nm23-H1 was 29.63%. The cases of Duke's stage D and distant metastatsis had higher frequency of the loss of heterozygosity. No mutation for nm23-H1 was found in colorectal carcinomas. These reaults indicate that the loss of heterozygosity for nm23-H1 may play a significant role in the malignant progression and distant metastasis in colorectal carcinomas.

　　Key words　　Colerectal neoplasm　　nm23-H1 gene　　Loss of heterozygosity　　Gene mutation

　　肿瘤抑制基因在肿瘤发生、发展过程中的重要特征是肿瘤细胞中该基因有一个或两个等位基因的丢失，肿瘤转移抑制基因可能也存在相同的改变。基因突变是肿瘤抑制基因失活的一个重要机理，大肠癌中p53基因和APC基因高频率突变是这些基因失功能的重要表现^〔1〕。基因突变通常可导致该基因表达的升高^〔2〕。nm23-H1基因在大肠癌中的表达呈普遍性增高^〔3〕，是否为该基因突变所致? 为此，我们采用Southern印迹杂交方法和RT-PCR-SSCP(反转录-聚合酶链式反应-单链构象多态性分析)银染、克隆及序列测定检测了36例大肠癌组织标本中nm23-H1基因杂合性缺失和突变情况，并观察其与大肠癌临床特征的关系。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本来源

　　36例大肠癌组织标本取自我院外科1994年5月至1995年5月住院手术治疗患者，并均经病理检查证实。男女各18例，年龄31～81岁，平均57.44岁。同时取自身正常大肠粘膜(距肿瘤边缘大于10cm处)作为正常对照。所取标本置液氮保存备用。

　　1.2　主要试剂

　　nm23-H1 cDNA质粒由美国Wang Liming博士赠送，插入片段为533 bp，载体为pBluescriptll sk +/-，片段长度2.96 kb， 酶切位点为EcoRⅠ，氨苄青霉素抗性。人nm23-H1-①引物，由北京医科大学分子病理室合成，扩增片段长度为366 bp，序列为5′-TTGAGCGTACCTCCATTACGATC-3′； 5′-TTTGC-ACTCCACAGAATCACT-3′。人nm23-H1-②引物，由美国Wang Liming博士赠送，扩增片段长度为533 bp， 序列为： 5′-AAGAATTCGGGTGCTGGCGGCTG；5′-GAGAATTCAATGTGGTCTGCCCTCC， 5′及3′端各有一部分非编码序列EcoRⅠ酶切点，专为克隆设计。α-³²P-dCTP(福瑞公司)，Random primer kit (promega), T4 ligase(华美生物工程公司)，T7 sequencing kit (pharmacia)。

　　1.3　方法

　　1.3.1nm23-H1探针制备^〔4〕　质粒DNA经纯化后用限制性内切酶EcoRⅠ消化。探针片段回收采用“V”字内槽电洗脱法。回收液经酚、酚氯仿及氯仿抽提，无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤纯化，最后用TE溶解(图1)。

　　1.3.2nm23-H1探针标记　采用Random primer标记法。

　　1.3.3基因组DNA提取^〔4〕　按常规酚-氯仿-异戊醇抽取基因组DNA，TE溶解，测OD₂₆₀和OD₂₈₀值定量，于-4℃存放备用。

　　1.3.4Southern印迹杂交^〔4〕　DNA酶切，电泳分离，转膜，预杂交，杂交(甲酰胺体系)，-70℃放射自显影3～7天。

　　1.3.5RT-PCR方法^〔3〕及PCR-SSCP银染^〔5〕　参照文献〔3〕和〔5〕(所用引物为人nm23-H1-①)。结果判定： 以同一患者肿瘤组织与正常大肠粘膜PCR产物配对电泳，银染色后观察二者电泳条带的差异。若条带增加、减少或位置变化，即视为肿瘤标本存在基因突变。

　　1.3.6克隆^〔4〕　质粒载体puc19与PCR产物(所用引物为人nm23-H1-②)的连接、转化，α-互补及蓝白斑克隆，筛选含重组质粒的细菌菌落，挑选白斑行小规模DNA提取鉴定(图2)。

　　1.3.7序列分析　参照Sanger双脱氧末端终止法进行测定^〔4〕。用克隆作模板，正反引物从两个方面进行。

图1　nm23-H1质粒EcoRⅠ酶切结果

　　1～3分别为nm23-H1质粒、酶切片段及回收的nm23-H1探针片段；M为λDNA/HindⅢ DNA 的标记

图2　nm23-H1 RT-PCR产物(533bp)与pUC19载体重组

　　1～4分别为线状pUC19(EcoRⅠ酶切)、pUC19质粒、nm23-H1 RT-PCR产物及重组体； M为λDNA/HindⅢ DNA的标记。

　　2　结果

　　2.1　大肠癌中nm23-H1基因杂合性缺失(LOH)

　　人基因组DNA经EcoRⅠ消化，与nm23-H1探针杂交产生2.4 kb和4.6 kb两条杂交带。含有两条杂交带的个体为杂合子，含其中一条杂交带者为纯合子。本组36例大肠癌标本中27例属于杂合子，其中8例发生LOH(图3)。

图3　nm23-H1 Southern印迹杂交结果显示

　　T21、23分别有2.2 kb和4.6 kb条带丢失

　　2.2　大肠癌中nm23-H1 LOH与其临床特征的关系

　　见附表。由附表可见，Duke’s D期大肠癌中nm23-H1基因LOH率显著高于Duke’s A、B、C期(P＜0.05)，有远处转移者nm23-H1 LOH率也显著高于无远处转移者(P＜0.05)； 但nm23-H1 LOH与大肠癌患者年龄、性别、肿瘤大小和位置、组织学分级、淋巴结转移及血清CEA水平之间均无明显关系(P＞0.05)。

附表　nm23-H1 LOH与大肠癌临床特征的关系

临床特征	缺失	未缺失	P
年龄(岁，±s)	53±8.60	55.89±12.94
女	4	6
男	4	13
肿瘤大小(cm，±s)	6±1.51	4.53±1.65
肿瘤位置　　　近端	3	4
远端	5	15
Duke's分期　　A期	0	3	＜0.05
B期	3	10
C期	2	5
D期	3	1
组织学分级　　高分化	1	6
中分化	7	9
低分化	0	4
淋巴结转移　　无	3	13	＜0.05
有	5	6
远处转移　　　无	5	18	＜0.05
有	3	1
血清CEA水平　＜15 mg/ml*	5	16
≥15 mg/ml	3	3

　　*我院正常值2.3　RT-PCR-SSCP银染

　　本组36例大肠癌标本中，RT-PCR-SSCP银染的nm23-H1基因突变检测无1例异常条带出现。癌组织与自身正常大肠粘膜中nm23-H1扩增产物的单链之间也无明显差异(图4)。

　　2.4　克隆测序

　　5例有广泛侵犯或远处转移病例标本经克隆测序，其nm23-H1编码序列与正常一致。

图4　nm23-H1 RT-PCR-SSCP银染结果

　　N：正常； T： 肿瘤； M1、M2分别为pBR322/HaeⅢ和λDNA/HindⅢ-EcoRⅠ DNA的标记

　　3　讨论

　　虽然nm23基因的确切功能尚不明了，但众多研究表明，nm23基因确在信号传递、细胞增殖和分化过程中起重要的调节作用。人类恶性肿瘤中nm23基因的缺失、突变及扩增等都可能影响其正常功能的发挥^〔6〕。

　　已发现，nm23-H1基因的LOH存在于人类多种恶性肿瘤，但不同肿瘤中该基因LOH的发生率相差甚大。在乳癌、肺癌、肝癌及肾癌中发生率分别可高达64%、42%、24%及20%，就大肠癌而言其发生率从13%～52%不等^〔6〕。本组26例中27例呈现杂合性状态(占75.00%)，8例发生nm23-H1基因的LOH，缺失率为29.63%。

　　本组3例Duke’s A期中无1例表现为nm23-H1 LOH， 13例B期和7例C期中分别有3例及2例发生LOH(发生率分别为23.08%及28.57%)。4例有肝脏、腹腔或他处广泛转移的晚期患者中，有3例出现LOH(发生率为75.00%)，与前3者相比差别十分显著。Wang等^〔2〕在20例大肠癌中也发现，8例伴有淋巴结或其他器官转移的大肠癌患者中，2例癌标本中nm23-H1等位基因丢失，而另外12例无转移的大肠癌标本中无丢失发生。说明nm23-H1基因LOH可能是大肠癌恶性进展的晚发事件，与大肠癌严重侵袭性行为紧密相关，并由此提示nm23-H1基因可能参与了人大肠癌恶性进展及转移过程的调节。

　　PCR-SSCP是一种DNA单链凝胶电泳技术。该技术操作简便、快捷、灵敏，无需特殊设备和试剂，特别是近年建立的银染方法，克服了同位素法的一系列限制，目前已广泛应用于快速筛选和检测基因突变的DNA多态性^〔7〕。新型银染技术是根据核酸分子带有多个氨基和亚氨基，在一定条件下可与银离子结合，在甲醛等还原剂作用下生成黑或褐色银沉淀条带。RT-PCR-SSCP是在PCR-SSCP基础上建立的扩增cDNA模板进行检测单链构象技术，它不同于PCR-SSCP之处即在扩增前经过一次从总RNA到cDNA第一链的合成。该方法对小于400bp的PCR产物最有效^〔8〕。本研究中，nm23-H1基因PCR扩增产物为366bp，这就保证了本实验结果具有一定的准确性和可信性。但因nm23-H1基因蛋白编码区由456个碱基组成，本研究扩增的为其中部的366个碱基，故不排除366bp两端共90bp出现突变的可能。为求操作更方便，我们对PCR-SSCP银染进行了改进^〔5〕，并将改进后的方法结合RT建立了RT-PCR-SSCP银染技术，应用于研究大肠癌中nm23-H1基因的突变情况。

　　序列分析法是检测基因突变最直接可靠的方法^〔9〕。它既能研究突变的位置和类型，又能进一步验证其它检测方法的准确性。只是存在操作复杂、工作繁琐、耗时费资、对技术要求高等缺点。本组36例大肠癌及其相应正常粘膜nm23-H1 cDNA扩增片段经琼脂糖凝胶电泳分析，未发现异常片段扩增^〔3〕。这些大肠癌经RT-PCR-SSCP银染技术未见1例该基因存在突变。为进一步排除PCR-SSCP技术的假阴性以及由于本研究的PCR产物稍大带来的敏感性下降这一问题，我们选择nm23-H1基因突变可能性较大的5例有广泛侵犯或远处转移的大肠癌标本进行了序列分析。结果也未见1例突变发生。说明nm23-H1基因突变在大肠癌中至少较为少见，该基因突变并不是大肠癌发生、发展及远处转移过程中的普遍性事件。

　　参考文献

　　1　Hirayama R, Wawai S, Takagi Y, et al. Positive relationship between expression of antimetastatic factor (nm23 gene productor nucleoside diphosphate kinase) and good prognosis in human breast cancer. J Natl Cancer Inst, 1991; 83(15)∶1249

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　　3　骆成玉， 祝学光， 王申五. 大肠癌中nm23-H1表达的定量研究及临床意义. 中华医学遗传学杂志， 1996； 13(5)∶277

　　4　Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: laboratory manuals. 2th ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989∶463-469

　　5　薛　涛， 祝学光，骆成玉. 应用PCR-SSCP银染技术检测结直肠癌p53基因突变. 中华实验外科杂志， 1996； 13(1)∶21

　　6　骆成玉， 祝学光. nm23基因的研究近况及其临床应用前景. 国外医学外科学分册， 1995； 22(1)∶24

　　7　Suzuki Y, Orita M, Shiraishi M, et al. Detection of ras gene mutation in human lung cancers by single-strand conformation polymorphisms analysis of PCR products. Oncogene, 1990; 5(7)∶1037

　　8　Caroline M. Relative efficiency of denaturing gradient gel electrophoresis and single strand conformation polymorphism in the detection of mutations in exon 5 to 8 of the p53 gene. Oncogene, 1994; 9(11)∶1739

　　9　Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, et al. DNA sequencing with thermusaquaticus DNA polymerase and direct sequencing of PCR. Proc Natl Acd Sci USA, 1988; 85(24)∶9436

(1998-05-14收稿，1998-12-01修回)