肺癌组织和癌性胸液细胞端粒酶活性测定研究
中华结核和呼吸感染 2000年第7期第23卷 论著摘要
作者：倪松石 冯健 王惠民
单位：226001 江苏省南通医学院附属医院
组织细胞中端粒酶活性高低与细胞分裂和细胞衰老过程密切相关，尤其是在恶性肿瘤组织存在异常高的端粒酶活性［1］。我们应用端粒重复扩增（TRAP）结合自行设计的萤光素（FITC）－抗萤光素酶偶联微孔板呈色法检测了29例肺癌组织和29例癌性胸液标本中的端粒酶活性，并与非肿瘤肺组织和非癌性胸液细胞中端粒酶活性进行比较。
材料与方法 组织标本均来自本院纤维支气管镜活检和手术患者。其中29例肺癌患者经病理学诊断证实；29例癌性胸液中11例系肺癌经病理学证实，9例经脱落细胞学证实，其余9例经影像学及其它临床辅助检查证实。18例非肿瘤肺组织均为本院手术切除标本，11例对照组胸液为经临床证实的结核性胸膜炎患者。取组织100 mg用手术刀片切成薄片，研磨均匀。组织碎片悬浮于200 μl冷裂解液中，冰水浴30 min，12 000 r/min离心30 min，4℃取上清迅速置-30℃，同时取50 μl上清用考马斯亮蓝法测蛋白含量。用0.2 ml离心管底加5.75 μmol/L 上游引物（CX）2 μl，加10 μl低熔点石蜡，在石蜡凝固后加46 μl聚合酶链反应液，其终浓度为10倍浓缩反应液5 μl，1.5 mmol/L MgCl2，0.1 g/L明胶，200 μmol/L 脱氧三磷酸核苷（dNTP），0.23 μmol/L下游引物（TS），2 U耐热DNA聚合酶（Taq酶）。测定时加入样本处理上清液2 μl，25℃ 30 min，94℃5 min，94℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 90 s，30个循环，72℃ 10 min。将链霉亲和素（Streptavidin）溶于pH 10.0碳酸盐缓冲液中10 mg/L，于微孔板每孔加100 μl，4℃过夜，pH 7.4磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次。取0.6 mol/L NaOH与扩增产物等量混合，室温10 min。于微孔板中加入100 μl杂交液，25 μl变性混合液，37℃ 1 h，pH 7.4 PBS洗3次，加入酶标抗体100 μl，37℃ 30 min，洗板3次，加四唑盐（TMB）呈色液100 μl，37℃ 10 min，加2 mol/L H2SO4 100 μl，分别于酶标仪450 nm与690 nm比色。
结果 不同病理类型肺癌组织端粒酶阳性检测率比较见表1，良恶性组织与胸液细胞端粒酶阳性检测率比较见表2。不同病理类型肺癌其端粒酶活性阳性相比差异无显著性（χ2=0.04，P＞0.05）。18例非癌肺组织的端粒酶活性无1例阳性，与肺癌组织的阳性率相比差异有显著性。（χ2 =32.58，P＜0.001）。癌性胸液与非癌性胸液细胞中端粒酶活性两组阳性率相比差异有显著性（χ2=18.08，P＜0.01）。
表1 不同病理类型肺癌组织端粒酶阳性检出率比较
| 分型 |
例数 |
阳性数 |
阳性率（％） |
| 鳞癌 |
11 |
10 |
90.9 |
| 腺癌 |
13 |
11 |
84.6 |
| 未分化癌 |
3 |
3 |
100.0 |
| 腺鳞癌 |
2 |
2 |
100.0 |
表2 良恶性组织与胸液细胞端粒酶阳性检测率比较
| 样本名称 |
例数 |
阳性数 |
阳性率（％） |
| 肺癌 |
29 |
26 |
89.7 |
| 非癌肺组织 |
18 |
0 |
0 |
| 癌性胸液 |
29 |
24 |
82.8 |
| 良性胸液 |
16 |
2 |
12.5 |
讨论 研究表明，大多数肿瘤组织细胞均有较高水平的端粒酶表达。而且在一些前侵袭性病变端粒酶表达的频率很高，表明端粒酶激活是癌症多步骤形成过程中的早期事件［2］。由于端粒酶在大部分恶性肿瘤中检出率很高，而且在正常组织或良性肿瘤组织中多为阴性，因此有可能用作癌症筛选的标志物。通过纤维支气管镜获取组织标本，作端粒酶活性测定，不失为一种能在术前明确肺癌诊断积极有效的手段。我们的资料显示胸液的端粒酶测定作为胸液细胞学检测的辅助手段，提高癌性胸液的诊断率。我们在16例良性胸液中，也检测到2例端粒酶呈阳性反应，这可能与胸液中的炎性细胞低水平表达端粒酶活性的特性有关［3］。端粒酶在肺癌组织中的高表达、在恶性胸液中的高阳性率，提示其在恶性肿瘤诊断尤其是良恶性胸液鉴别诊断方面有着广泛的前景。
参考文献
1，Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994,226 :2011-2014.
2，Breslow RA,Shay JW, Gazdar AF, et al. Telomerase and early detection of cancer: a national cancer institute workshop. J Natl Cancer Inst, 1997,89:618-623.
3，Couter CM, Gupta J, Harley CB, et al. Telomerase activity in normal leukocytes and in hematologic malignancies. Blood, 1995,85:2315-2320.
(收稿日期:1999-10-29)
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