抑癌基因p53及p16单独或共转染治疗非小细胞肺癌的动物实验研究
中华结核和呼吸杂志2000年第23卷第7期
吴文青 张晓春 齐协飞 范希光 饶纬华
摘 要 目的 观察抑癌基因p53和p16单独或共转染在动物整体中治疗非小细胞肺癌（NSCLC）的效果。方法 采用培养细胞移植法，将人NSCLC细胞系A569接种于裸小鼠背部皮下，建立裸小鼠皮下肺癌移植瘤模型。将25只荷瘤裸小鼠随机分成空白对照组、十八酰基胺阳离子(SA)对照组、p53基因组、p16基因组、p53+p16基因组，共5组，每组5只。采用瘤体内直接注射的方法，用SA脂质体介导，将p53和(或)p16基因注入移植瘤体内，每周测量瘤体体积，以观察抑癌基因p53和p16单独或共转染治疗NSCLC移植瘤的效果，同时记录各组荷瘤裸小鼠存活情况，以观察p53和(或)p16基因对荷瘤鼠存活的影响。结果 p53、p16基因单独转染及共转染均能显著抑制肿瘤体积增长，p53和p16基因单独或联合治疗组与空白对照组或SA脂质体对照组比较增长值差异有显著性(P＜0.01)，p16基因较p53基因抑制作用为强，而以p53和p16基因联合组作用最强。p53和p16基因单独或联合治疗组裸小鼠存活期均延长，以p16基因单独治疗组和p16、p53基因联合治疗组裸小鼠存活期更长。结论 抑癌基因p53、p16可能用于NSCLC的基因替代治疗，p53和p16基因联合应用具有更强的治疗效果。
关键词：p53基因 p16基因 肺癌 基因治疗
肺癌的抑癌基因替代疗法是目前肺癌基因治疗研究热点之一。为了探讨抑癌基因p53和p16用于肺癌基因替代疗法的可能性，本实验采用培养细胞移植法，建立裸小鼠皮下肺癌移植瘤模型，将p53和(或)p16基因注入移植瘤体内，观察抑癌基因p53和p16单独或共转染治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的效果。
材料与方法
一、裸小鼠皮下肺癌移植瘤模型的制备
肺腺癌细胞系A549购自上海细胞生物研究所，用补充10%小牛血清的RPMI1640培养基培养。SPF级BalB/CA-nu品系裸小鼠，由中国医学科学院动物繁育场提供(动物质量合格证号为医动字第01-1004号)，均为雌性，3～4周龄，体重约18 g。
裸小鼠皮下肺癌移植瘤模型的制备采用培养细胞移植法［1］。首先按姜泊等［2］方法进行A549细胞的培养并传代，收获大量生长达80%汇合的A549细胞，制成1×107/ml的细胞悬液，然后立即接种，接种部位选在裸小鼠背部近头端皮下，用1 ml注射器将0.1 ml A549细胞悬液注射于每只麻醉状态(乙醚吸入法)的裸小鼠背部近头端皮下,以建立皮下异种肿瘤移植的裸小鼠NSCLC模型。
二、重组基因及转染方法
野生型p16 cDNA、p53 cDNA的表达型质粒(1 μg/μl)由美国华盛顿大学吴瑛博士惠赠，其cDNA的制备及表达型质粒的重组按文献［3,4］进行。
十八酰基胺阳离子(SA)脂质体(2 μg/μl,购自上海中科院生物化学研究所)介导p53、p16基因转染按杨静平等［5］方法进行，SA脂质体与质粒DNA重量比为10∶1，混匀，室温放置25 min，形成混合物，然后进行实验。
三、移植瘤生长抑制实验及观察
肿瘤移植15 d后，将荷瘤裸小鼠随机分成5组，每组5只。当肿瘤移植1个月后，直径增至7～10 mm时，开始抑癌基因p53和(或)p16的治疗。采用瘤体内直接注射法［6］，每日注射1次，连续5 d，以后每半月加强一次。(1)空白对照组：每只注入生理盐水180 μl/次；(2)SA脂质体对照组：每只注入SA脂质体180 μl /次；(3)p53基因组：每只注入SA 300 μg＋p53质粒30 μg/次；(4)p16基因组：每只注入SA 300 μg＋p16质粒30 μg/次；(5)p53与p16基因联合组：每只注入SA 300 μg＋p53质粒15 μg＋p16质粒15 μg/次。当治疗至第11周时，每组取1只小鼠，处死后作移植瘤的病理切片。
用游标卡尺每周测量移植瘤的长径（A）、短径（B），按V＝1/6πAB2计算移植瘤体积（V）。记录每只裸小鼠的存活时限(从连续治疗5 d后算起，以150 d为限)。
四、统计方法
采用方差分析处理实验数据，采用2×2析因分析，观察p16、p53基因有无交互作用，观察p16、p53基因单独或联合应用时的效果。
结果
一、p53和(或)p16基因对移植瘤生长抑制作用
空白对照组、SA脂质体对照组移植瘤呈进行性生长趋势，p53基因组移植瘤生长迟缓，p16基因组、p53与p16基因联合组移植瘤生长受到明显抑制，其中以p53与p16基因联合组抑制作用最为显著(P＜0.01)。如图1所示，空白对照组［(6.6±0.5) cm3］与SA脂质体对照组［(6.4±0.4) cm3］比较移植瘤体积增长差异无显著性(P＞0.01)，p53基因组［(2.2±0.3) cm3］、p16基因组［(1.2±0.3) cm3］、p53与p16基因联合组［(0.4±0.2) cm3］三个治疗组与对照组比较移植瘤体积增长值差异有显著性(P＜0.01)，三个治疗组互相比较，移植瘤体积增长值差异也有显著性(P＜0.01)，2×2析因分析说明p53与p16基因存在协同增强作用。结果表明：p53、p16基因均能显著抑制移植瘤的生长，抑制作用的大小为：p53与p16基因联合组＞p16基因组＞p53基因组。
图1 治疗后第10周与治疗前相比各组裸小鼠移植瘤体积总增长值均数比较
从裸小鼠肉眼观察发现，两对照组裸小鼠移植瘤治疗过程中出现表面坏死，治疗后期裸小鼠有恶液质表现，而治疗组治疗过程中移植瘤表面光滑完整，裸小鼠无恶液质表现(图2，3)。治疗后第11周时，每组取1只小鼠，处死后作移植瘤的病理切片，发现对照组有大量坏死组织，治疗组未见坏死组织，且每只裸小鼠的心、肝、肺、脑、肾等重要脏器未见转移病灶，淋巴结无转移。
表1 各组荷瘤裸小鼠经不同治疗后的存活期(d,x±s)
| 组别 |
鼠数 |
存活期(d) |
| 空白对照组 |
4 |
77±7 |
| SA对照组 |
4 |
76±5 |
| p53基因组 |
4 |
132，140，＞150(2/4) |
| p16基因组 |
4 |
＞150 |
| p53+p16基因组 |
4 |
＞150 |
注：治疗后第11周时，每组取1只小鼠，处死后作移植瘤的病理切片，剩余4只小鼠作存活期的观察 二、经不同治疗后的荷瘤裸小鼠存活期比较
如表1所示，两对照组存活期比较差异无显著性(P＞0.01)，p53基因组存活期比空白对照组或SA脂质体对照组显著延长(P＜0.01)，p16基因组、p53与p16基因联合组效果更佳，治疗后150 d无一只裸小鼠死亡。
讨论
肺癌的发生源于多基因异常，抑癌基因的缺失和（或）突变是导致肺癌发生的重要原因。许多研究者都在探索肺癌的抑癌基因治疗，通过将外源正常的抑癌基因如p53基因、p16基因等导入肺癌细胞，增强抑癌基因抑制细胞增殖的功能，从而抑制肺癌细胞的恶性增长，达到治疗肺癌的作用。本实验在动物整体水平单独或联合应用野生型抑癌基因p53和p16，对已建立的裸小鼠皮下肺癌移植瘤进行实验性治疗，观察单独或联合应用p53、p16基因的抑癌作用的大小，以探索抑癌基因治疗肺癌的可能性及有效方法。
细胞水平及动物体内的许多研究表明［6-9］，单独运用病毒或非病毒载体的正常的外源抑癌基因p53、p16具有明显的抑制肺癌的效果，本实验与文献结果一致。抑癌基因p53、p16的肿瘤抑制效应与其在细胞周期中的作用有关。p53、p16基因在正常细胞增殖中起负反馈作用，与成视网膜细胞瘤基因（Rb）、细胞周期素（cyclin)、细胞周期依赖性激酶（cyclin dependent kinase，CDK)等共同组成细胞周期反馈调节环，调控细胞周期G1期至S期的改变。野生型p53基因的表达产物p53蛋白间接作用于细胞周期，p53蛋白可促进p21蛋白(CDK2抑制剂)的表达，p21蛋白则通过与cyclin E/CDK2复合物结合而抑制CDK2的活性，从而在细胞周期中抑制G1期至S期的转换，阻碍细胞进入DNA合成期，使细胞分裂和生长受到抑制。而p16蛋白具有直接的细胞生长抑制效应，p16蛋白与cyclin D竞争同CDK4的结合，当p16蛋白与CDK4结合后，CDK4/cyclin复合物活性受到抑制，细胞分裂生长受阻。对于本实验中p16基因抑制肿瘤生长作用比p53基因强的解释，可能与形成移植瘤的NSCLC细胞系A549有关，经检测A549细胞存在p16基因纯合性缺失［10，11］，并且存在野生型p53基因及Rb蛋白表达［10］。有研究［7］发现对于本身具有野生型p53基因的肺癌细胞，导入外源野生型p53基因后，也可产生生长抑制作用，但较弱。
抑癌基因p53、p16联合共转染，具有更显著的肿瘤抑制作用。本研究中心的体外研究结果［11］表明，p53和p16基因联合共转染能显著增强对NSCLC细胞增殖的抑制。本实验在动物体内对p53、p16基因联合共转染与单独转染进行比较，发现共转染可更显著抑制裸小鼠皮下肺癌移植瘤的生长，p53、p16基因具有协同增强作用。此种协同作用的机制可能与两基因通过不同途径在细胞周期中共同起负调控作用有关；p53、p16基因的细胞周期作用最后都要通过Rb基因完成，Rb基因表达产物Rb蛋白非磷酸化时可阻止细胞由G1期进入S期，被磷酸化后Rb蛋白的G1期停滞作用丧失；p53、p16蛋白可抑制CDK/cyclin复合物活性，从而抑制其对Rb蛋白磷酸化的作用，进而抑制细胞G1期至S期的转换，抑制细胞增殖。
本研究结果提示：抑癌基因p53或p16，以及p53与p16联合对A549肺癌细胞系裸鼠移植瘤的基因治疗效果，可能为人类NSCLC基因治疗提供有意义的实验资料。
图2 治疗第10周p53与p16基因联合组裸小鼠活动自如，移植瘤表面光滑完整
图3 治疗第10周空白对照组裸小鼠恶液质表现，移植瘤表面坏死
(本文图2，3见插页第17页)
基金项目：国家自然科学基金资助项目（39760032）
作者单位：张晓春（330006 南昌,江西医学院第二附属医院分子医学研究中心)
齐协飞（330006 南昌,江西医学院第二附属医院分子医学研究中心)
范希光（330006 南昌,江西医学院第二附属医院分子医学研究中心)
饶纬华（330006 南昌,江西医学院第二附属医院分子医学研究中心)
吴文青（江西医学院第一附属医院呼吸科）
参考文献
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