不同转移潜能的人胰腺癌JF305单克隆细胞亚系的建立

中国普外基础与临床杂志 1999年第6期第6卷 基础与实验研究

作者：崔宏　何三光　刘永锋　王士勇　王晓华　王宏　戴晓纯　宗阿南　何安光

单位：崔宏　何三光　刘永锋（中国医科大学第一临床学院普外一科　沈阳　110001）；王士勇　王晓华　王宏　戴晓纯　何安光（中国医科大学肿瘤研究所胰癌研究室）；宗阿南（中国医科大学动物部）

　　关键词： 胰腺癌；细胞系；转移潜能；人癌裸小鼠原位移植

　　摘要　为研究胰腺癌的转移机理，在我校原建立的人胰腺癌JF305细胞系基础上，利用细胞克隆，细胞电泳，流式细胞仪及人癌裸小鼠原位移植技术，建立了具有不同转移潜能的人胰腺癌JF305单克隆细胞亚系和具有不同转移潜能的人胰腺癌单克隆细胞亚系裸小鼠原位移植模型。结果表明该单克隆细胞亚系及其肿瘤移植模型的建立，为探讨胰腺癌转移机理提供了较理想的研究方法。

THE ESTABLISHMENT OF THE MONOCLONAL CELL SUBLINES WITH DIFFERENT METASTATIC POTENTIAL FROM HUMAN PANCREATIC CANCER JF305

Cui Hong, He Sanguang, Liu Yongfeng, et al.

　　First Department of General Surgery, First Clinical College, China Medical University, Shenyang 110001

　　Abstract　On the basis of established JF305 cell line from human pancreatic cancer at this university, cell clone technique, cell electrophoresis, flower cytometer, and cancer orthotopically implanted nude mice technique were used to establish the sublines with different metastatic potential from human pancreatic cancer line-JF305 and the nude mice model implanted orthotopically with human pancreatic cancer monoclonal sublines with different metastatic potential. The results showed that the monoclonal cell sublines with different metastatic potential from human pancreatic caner-JF305 and the nude mice model implanted orthotopically with the sublines, would provided a useful method to study the metastatic mechanism of human pancreatic cancer.

　　Key words　　Pancreatic neoplasma　　Cell line　　Metastatic potential　　Cancer orthotopically implanted nude mice

　　肿瘤组织含有许多表型差异的细胞亚群，它们在生物学特征上表现异质现象。而单克隆细胞亚系能做到异质性最低，是研究肿瘤转移最理想的材料。为研究胰腺癌的转移机理，我们在人胰腺癌JF305细胞系^〔1〕基础上，建立了具有不同转移潜能的人胰腺癌JF305单克隆细胞亚系； 并采用癌原位移植技术，建立了具有不同转移潜能的人胰腺癌单克隆细胞亚系裸小鼠原位移植模型，对不同的转移潜能做了验证。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　JF305细胞系(源于中度分化的人胰腺导管癌，由我校肿瘤研究所提供)； 裸小鼠(BALB/C-nu/nu，购于中国医学科学院)； 胰酶(1∶250 AMRECO，USA)； RPMI 1640(GIBC，USA)； 核糖核酸酶A(SABC产品)； PBS(pH 7.5)； 碘化丙啶(SABC产品)； 二氧化碳培养箱(USA)； 倒置显微镜(OLYMPUS， Japan)； 细胞电泳仪(Cambrige England)； 流式细胞仪(FCM，FACScan BECTON DICKINSON)。

　　1.2　方法

　　1.2.1　单细胞克隆分离　JF305细胞胰酶消化制成细胞悬液，其浓度为25.4个/ml，接种96孔培养板，每孔加50 μl(平均1.0个细胞/孔)，共两块培养板，每孔另加培养液250 μl。对确认含单细胞孔加标志。培养1周后，观察标志孔单细胞集落形成。2周时换培养液1次。细胞长满孔底时，转种培养瓶内充分扩增。

　　1.2.2　细胞电泳检测　各单细胞克隆获得的细胞制成细胞悬液，PBS洗3次，使成悬液，加入细胞电泳仪，在20V电压，37℃下检测细胞电泳速度(测定细胞在电场中自由泳动60 μm，正向和反向各1次所需时间，据公式算出电泳速度)^〔2〕。

　　1.2.3　流式细胞仪检测　各细胞亚系分取5份标本，每份含1×10⁶个细胞，加入0.1 ml PBS成悬液，注入4℃的70%冷乙醇，1 500 r/min离心5分钟，弃乙醇，PBS洗2次，悬于PBS中，加RNaseA(每标本加3 000活性单位)，37℃孵育30分钟后放入冰浴中。加入0.5 ml的碘化丙啶(50 μg/ml)行DNA染色30分钟。用流式细胞仪(FCM)检测。

　　1.2.4　生长曲线观察　各细胞亚系制成细胞悬液计数，分别加入24孔板，每孔1×10⁴个细胞，培养次日开始，胰酶消化孔内细胞，计数活细胞，每天每板计数3孔，取平均值，连续7天。每2天换培养液1次，细胞倍增时间按Patterson公式计算： TD＝T1g2/1g(N/N₀)(TD： 倍增时间，T： 时间间隔，N₀： 起点细胞数，N： 终点细胞数)。

　　1.2.5　裸小鼠胰腺内原位移植　各亚系制成1×10⁷/ml 悬液，取0.3 ml分别接种1只裸小鼠双侧腋窝皮下，待肿物长至直径为2～3 cm时，乙醚麻醉切除肿瘤，将其切成1mm ×1 mm ×1 mm组织切片，PBS漂洗3次待用。乙醚麻醉肿瘤裸小鼠，经左肋缘下切口进腹腔，将胰腺被膜切一小口，把小片瘤组织置被膜下，11-0无损伤缝合线缝合固定，1号丝线缝合腹部切口。各细胞亚系的组织片，分别接种于5只裸小鼠。无菌饲养。于裸小鼠死亡后立即或移植后4周处死，行系统解剖，留取病理标本。

　　2　结果

　　2.1　单细胞克隆分离

　　获标志的单细胞56孔，培养的各阶段经观察，淘汰可疑细胞孔，最终得到11个单克隆细胞亚系，编号为N_1～11。

　　2.2　细胞电泳速度

　　将N_1～11各细胞系分别行细胞电泳检查，结果见表1。由表1可见，各细胞亚系的细胞电泳速度大小经t检验，P＜0.01； 将其分成3组： 高转移组为N₁； 中转移组为N_2～4； 低转移组为N₈，N₉，N₁₁。

表1　单克隆细胞亚系细胞电泳速度(±s)

　　2.3　流式细胞仪检测

　　将高、中、低转移组细胞分别行FCM检测，分别于高、中、低转移组选出G₂/M比率相差悬殊者，经t检验P＜0.01，最终确定N₁，N₃，N₁₁为具有高、中、低转移潜能的单克隆细胞亚系(见表2)。

表2　各转移组单克隆细胞亚系的比率(G₂/M，±s)

　　2.4　生长曲线

　　细胞倍增时间分别为N₁ 32.63小时； N₂ 38.90小时； N₃ 65.67小时。提示N₁生长活跃，N₃次之，N₁₁生长较慢。见附图。

附图　细胞生长曲线

　　2.5　裸小鼠原位移植

　　胰腺原位移植后转移情况，见表3。

表3　胰腺原位移植后转移情况

　　^*平均存活20.6天

　　3　讨论

　　3.1　不同转移潜能的人胰腺癌单克隆细胞亚系的建立

　　转移的形成不仅是肿瘤细胞对某器官环境的适应，还包括原发瘤存在不同转移潜能的瘤细胞亚群^〔2〕。从异质性母细胞系群体中分离出来的单细胞克隆亚系，因其异质性可减至最低，且转移能力表达稳定，非常有利于比较性实验。

　　本实验利用细胞电泳速度与肿瘤转移潜能的关系，对人胰腺癌JF305细胞系进行初筛，并结合检测细胞的G₂/M期比率，获得了3个单克隆细胞亚系。将其原位植入裸小鼠胰腺被膜下，证实其转移潜能与细胞电泳速度成正相关，即高转移潜能者的细胞电泳速度明显高于低转移潜能者。高进等^〔3〕曾报道不同肿瘤细胞株电泳率的差异与其转移能力成正相关。随后许多人利用细胞电泳率作为初筛指标，建立了源于同一母系具不同转移性的克隆细胞株，并进行了一系列生物学性质的对比研究，证明肿瘤细胞的电泳率或电泳速度与转移潜能成正相关^〔4，5〕。因此我们认为对肿瘤行细胞电泳检测，客观、易操作、重复性好，确为筛选不同转移潜能细胞的好方法。

　　3.2　裸小鼠胰腺内原位移植模型的建立

　　在验证转移潜能时，本实验采用了先进的裸小鼠原位移植技术，以往多数人类癌移植实验采用皮下植入途径，但移植瘤少见转移，如本研究用的母系JF305建系时采用皮下移植方式，并未出现转移^〔1〕。皮下植入法因植入瘤形成纤维包膜，干扰瘤体血管分布，阻碍其生长与转移，用于转移的研究并不理想。研究人癌转移的合适模型，应允许肿瘤细胞和它们相关的器官环境相互作用，人胰腺癌裸小鼠胰腺内原位移植模型是人体外研究胰腺癌转移的最理想实验工具^〔6〕。国内只有刘秋珍等^〔7〕利用手术组织块建立过此模型，尚未见用人胰腺癌单克隆细胞亚系建立的人裸小鼠胰腺内原位移植模型。我们采用先将培养一定数量的细胞植于一裸小鼠皮下，待成瘤后切除肿瘤，将该瘤组织块再植入其他裸小鼠的胰腺被膜下，这比直接将细胞植入胰腺被膜下的方法成功率高。

　　参考文献

　　1　李昕，王宏，姜奕等. 表达p53基因的人胰腺癌细胞系JF305的建立. 中华肿瘤杂志，1994； 16(3)∶181

　　2　高进主编. 癌的侵袭与转移. 第1版. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社， 1996∶2～3

　　3　高　进， 钱书森，薛克勋等. 两个小鼠前胃癌细胞株的不同电泳率与转移率之间的关系观察. 中国病理学杂志，1988；17(1)∶45

　　4　万海粟，赵雪梅， 高进. 小鼠肺腺癌LA795细胞系不同转移克隆株的分离及其膜质流动性的研究. 中国实验动物学杂志， 1993； 3(2)∶102

　　5　刘亚琴，高进. 转移潜能不同的小鼠肺腺癌亚系的生物学性质的比较研究. 基础医学与临床， 1993；13(2)∶36

　　6　Fidler JJ. Critical factors in the biology of human cancer metastasis. Cancer Res, 1990; 50(19)∶6130

　　7　刘秋珍，脱朝伟，张龙石等. 两株人胰腺癌裸鼠胰腺内原位移植模型的建立及其生物学特性. 解放军医学杂志，1993； 18(2)∶124

(1998-09-06收稿，1999-07-27修回)