鼻咽癌染色体3p14的精细等位基因缺失研究

中华耳鼻咽喉科杂志 2000年第5期第35卷 临床研究

作者：邓燕飞　田芳　杨新明　谢鼎华　卢永德　邵细芸　陈主初

单位：邓燕飞　杨新明　谢鼎华　卢永德（410011长沙 湖南医科大学附属第二医院耳鼻咽喉科）；田芳　邵细芸　陈主初（湖南医科大学肿瘤研究所细胞生物学研究室）

关键词：鼻咽肿瘤；染色体；人；杂合性丢失；等位基因

　　【摘要】　目的　研究鼻咽癌染色体3p14区域的精细等位基因杂合性丢失（loss of heterozygosity, LOH）情况，并探讨LOH与鼻咽癌临床分期、临床病理和EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）感染的关系。方法　采用3p14区域6个精确高密度的微卫星多态性位点，对32例患者鼻咽癌组织进行LOH分析。结果　32例患者中有23例（71.9%）在至少1个位点发生LOH，丢失频率较高的3个位点是D3S1313（46.4%）、D3S1300（50.0%）和D3S1312（44.4%）。在具有丢失的23例患者中，12例表现为一个连续的非随机的LOH区域，其最小共同缺失区为D3S1313～D3S1312。该区域的LOH与临床分期、EBV感染有明显关系。30例低分化鳞癌的LOH频率为70.0%，2例泡状核细胞癌均存在2个位点的LOH。结论　鼻咽癌染色体3p14区存在较高的LOH率，提示在D3S1313和D3S1312之间可能存在尚未克隆的与鼻咽癌发生发展相关的抑癌基因。

Precise map of allelic loss on chromosome 3p14 in nasopharyngeal carcinoma

DENG Yanfei　TIAN Fang　YANG Xinming

　　（Department of Otorhinolaryngology, Second Affiliated Hospital and Cancer Research Institute, Hunan Medical University, Changsha 410011, China）

　　【Abstract】　Objective　 To determine the precise allelic loss on chromosome 3p14 and discuss the possible relations between loss of heterozygosity (LOH) and EBV infection, clinical stage and clinic-pathology of nasopharyngeal carcinoma (NPC) .Methods　Six high dense microsatellite marker on chromosome 3p14 were selected to examine LOH in 32 cases of NPC. Results　23 of 32 (71.9%) tumors were deleted for at least one locus of six loci .High frequencies of LOH(＞40%) were observed at loci D3S1300(50.0%)，D3S1313(46.4%) and D3S1312(44.4%).12 cases showed LOH in one contiguous and nonrandom region. The smallest common deletion region seems likely to lie between D3S1313 and D3S1312. Relations between LOH on 3p14 and clinical stage and EBV infection were observed. The frequency of LOH was 70.0% in 30 cases of poor-differentiated squamous cell carcinoma. 2 cases of vesicular nucleus cell carcinoma had LOH at two loci. Conclusion　The high deletion rate on 3p14 in NPC indicates that there might be a putative tumor suppressor gene related to the development and progression of NPC.

　　【Key words】　Nasopharyngeal neoplasmas; 　 chromosomes,human;　 Loss of heterozygosity;　 Alleles

　　鼻咽癌在中国南方各省有较高的发病率和死亡率，流行病学调查显示鼻咽癌发病与遗传因素和环境因素（EB病毒、化学致癌物等）有关。细胞遗传学和分子遗传学研究发现鼻咽癌存在3号染色体短臂的结构异常和高频率的杂合性丢失（loss of heterozygosity，LOH)， 3p13-14.3、3p14.3-21、3p21.3-ter 是其中丢失频率较高的三个染色体区域^［1］。为了进一步了解鼻咽癌3p14区域LOH的频率及精细范围，精确定位可能存在的鼻咽癌抑癌基因的位置，我们选择6个位于3p14 区域的高密度微卫星多态标记，采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色技术对32例鼻咽癌患者进行LOH分析。

　　材料与方法

　　一、标本

　　未经治疗的32例原发性鼻咽癌组织及其配对的外周血组织来自湖南医科大学附属第二医院。活检组织被分成2份，一份送病理检查，一份立即保存于液氮中；每份外周血同时送EB病毒壳蛋白抗体-IgA（Epstein-Barr Virus Capsid Antigen-IgA，EBVCA-IgA）检测。30例低分化鳞癌，2例泡状核细胞癌，其临床分期按1992 UICC的TNM分期法。

　　二、DNA 提取

　　常规蛋白酶K消化，酚-氯仿抽提癌组织及正常组织DNA，紫外分光光度计定量后-20℃保存备用。

　　三、PCR反应

　　6个微卫星多态标记由湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室合成，其染色体定位及引物序列来自国际互联网的Genome 数据库(表1)。25 μl PCR反应体系中含基因组DNA 100 ng，上、下游引物各20 ng，10×PCR缓冲液2.5 μl，2 mmol/L dNTP 1.25 μl，Taq DNA聚合酶1U。94℃预变性5 min，经94℃30 s、57～62℃30 s、72℃40 s、28个循环后72℃延伸5 min。

　　四、LOH判定

　　5 μl PCR产物97℃变性5 min，上样于8%或10%的聚丙烯酰胺凝胶（含8 mmol/L尿素），350～450电泳3～4 h，银染后观察结果。将肿瘤组织与相应正常外周血DNA的PCR产物同时上样比较，若肿瘤的某一等位基因条带消失或相对密度减少50%以上，则判定为LOH。

　　结果

　　染色体3p14的6个微卫星多态性位点分析结果见表1和图1。32例鼻咽癌组织中，23 例在D3S3722和D3S1312之间表现出不同程度的LOH，占71.9%。LOH频率较高的三个位点：D3S1313、D3S1300、D3S1312，丢失频率分别为46.4%、50.0%、44.4%。而D3S3631位点未检测到LOH。有LOH的病例中，5例表现出2个或2个以上的LOH区域，12例表现为1个连续的非随机的LOH区域，丢失的最小共同区域为D3S1313～D3S1312。6例均只一个位点表现LOH，除1例外，LOH位点在D3S1313～D3S1312之间。

图1　代表性的凝胶电泳结果

　　2例泡状核细胞癌皆存在2个位点的LOH，且丢失区在共同缺失区内；30例低分化鳞癌中有21例存在LOH，频率为70.0%。鼻咽癌患者临床分期与3p14 LOH之间的关系，Ⅰ-Ⅱ期（7例）鼻咽癌组织LOH阳性1例，LOH阴性6例；Ⅲ-Ⅳ期（25例）鼻咽癌组织LOH阳性22例，LOH阴性3例。9例LOH阴性的患者，除3例为临床Ⅲ期外，其余均为Ⅰ-Ⅱ期；23例LOH阳性的患者，除1例为临床Ⅱ期外，其他均为Ⅲ-Ⅳ期。LOH阳性患者中，临床Ⅲ-Ⅳ期明显多于Ⅰ-Ⅱ期（χ²=14.7,P＜0.005）。在32例鼻咽癌患者中，外周血EBVCA-IgA滴度≥1∶20的有23例， 占71.9%，＜1∶20者9例。在LOH阳性患者中，有20例滴度≥1∶20；而LOH阴性患者中，只有3例滴度≥1：20，二者差异有显著性（χ²=9.20，P＜0.005）。

　　讨论

　　在许多肿瘤中均发现有3号染色体短臂缺失及等位基因杂合性丢失，3p14是其中一个较常见的丢失区^［2］。3p缺失及等位基因LOH在鼻咽癌中亦比较常见，其中以3p13-14.3 LOH频率最高^［1］。Huang等^［3］用RFLP方法检测到鼻咽癌D3S3（3p14）位点的丢失频率为100%；Lo等^［4］用微卫星多态性技术检测到67%（18/27）的鼻咽癌有3p LOH，D3S1288（3p14.3-14.1）位点频率最高,为53%；Hu等^［5］报道3p LOH频率为70%(12/17),其中D3S1217（3p14.2-14.1）位点为58%；Multirangura等^［6］报道3p LOH频率为78%（21/27），其中D3S1600（3p14）位点达75%（15/20）；Ohta等^［7］在鼻咽癌细胞系中发现有3p14.2区域的纯合性缺失。这些资料强烈提示3p14存在与鼻咽癌密切相关的抑癌基因。为构建3p14区更精细的等位基因缺失图，本研究选择该区域6个高密度微卫星多态性位点（遗传距离为3.5 cM,平均遗传间距约为0.6cM）检测了32例鼻咽癌组织，结果显示：71.9%（23例）的患者有LOH，频率最高的位点为D3S1300（3p14.2），其次为D3S1313（3p14.3）和D3S1312（3p14.2-14.1）。23例有LOH的患者中，12例表现出一个不同程度的连续的LOH区域，其最小共同缺失区位于D3S1313～D3S1312，二者的遗传距离为3.4cM。

表1　引物序列和不同位点LOH结果

　　注：L表示杂合性丢失例数；I表示信息个体数 　　位于染色体3p并且已经克隆的抑癌基因有VHL基因（3p25）、DLC1基因（3p21.3）、FHIT基因（3p14.2）。VHL已被排除为鼻咽癌的抑癌基因^［8］；DLC1最近才被克隆^［9］，编码1755个氨基酸的多肽，在肺癌、食管癌、肾癌中存在较高的异常转录本，其与鼻咽癌的关系尚不详；FHIT基因是否作为典型的抑癌基因在肿瘤中起作用目前尚有争议^［10］，虽然它位于我们的最小共同缺失区内，但文献只报道在3株鼻咽癌细胞系中检测到FHIT异常转录本，它是否为鼻咽癌的抑癌基因需进一步证实。因而认为染色体D3S1313～D3S1312区域可能存在其它的尚未克隆的抑癌基因，并在鼻咽癌的发生发展中起作用，本研究为该基因作了较精细的定位，为其克隆提供了依据。

　　2例泡状核细胞癌均检测到LOH，30例鼻咽低分化鳞癌的LOH 频率为70.0%（21例），LOH与鼻咽癌病理类型的关系尚需扩大样本进一步研究。Hu等^［5］与Deng等^［8］报道临床Ⅲ-Ⅳ期患者LOH程度较Ⅰ-Ⅱ期高，我们的结果亦显示，晚期的鼻咽癌患者更易发生3p的LOH。本组EBVCA-IgA滴度≥1：20的患者占71.9%（23例），与LOH频率相当，且在LOH阳性患者中，EBVCA-IgA滴度≥1：20者要明显多于＜1：20者；Multirangura等^［6］亦发现EBV感染的鼻咽癌3p14存在高频率的LOH；Rassool等^［11］已证实外源性DNA易整合入3p14的FRA3B脆性部位，并增加基因组的不稳定性，以上提示鼻咽癌3p14 LOH可能与EBV感染有关。因此，推测EBV发生作用的可能途径是将病毒DNA整合入3p14的特定部位，通过LOH使相应的抑癌基因失活而参与NPC的演进。

　　基金项目：国家自然科学基金（39500172）和卫生部课题基金（96-1-131）

参考文献

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　　3，Huang DP, Lo KW, Chio PHK,et al. Loss of heterozygosity on the short arm of chromosome 3 in nasopharyngeal carcinoma.Cancer Genet Cytogenet,1991,54:91-99.

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　　5，Hu LF,Eiriksdottir G,Lebedeva T,et al. Loss of heterozygosity on chromosome arm 3p in nasopharyngeal carcinoma.Genes Chromosomes Cancer,1996,17:118-126.

　　6，Multirangura A,Tanunyutthawongese C,Pornthanakasem W,et al.Genomic alteration in nasopharyngeal carcinoma: loss of heterozygosity and Epstein-Barr virus infection.Br J Cancer,1997,76:770-776.

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　　10，Le Beau MM,Drabkin H,Glover TW,et al.An FHIT tumor suppressor gene? Genes Chromosomes Cancer,1998,21:181-289.

　　11，Rassool FV,Le Beau MM,Neilly ME,et al.Increased genetic instability of the common fragile site at 3p14 after integration of exogenous DNA.Am J Hum Genet,1992,50:1243-1251.

（收稿日期：2000-01-20）