人类鼻咽癌端粒酶活性的研究及其临床意义

中华耳鼻咽喉科杂志 2000年第4期第35卷 临床研究

作者：彭宏　王希军　杨光彩　江肃萍　赵彤

单位：彭宏　王希军　江肃萍（510515 广州 第一军医大学南方医院耳鼻咽喉科）；杨光彩（第一军医大学生物化学教研室）；赵彤（第一军医大学病理学教研室）

关键词：鼻咽肿瘤；端粒；末端转移酶；淋巴转移

　　【摘要】　目的　探讨端粒酶在鼻咽癌中的表达及其临床意义。方法　采用TRAP-银染法对42例鼻咽部低分化鳞状细胞癌、10例鼻咽部正常粘膜和8例鼻咽纤维血管瘤进行端粒酶活性检测及血清VCA/IgA检测，并分析其与临床病理的关系。结果　鼻咽部正常粘膜和鼻咽癌端粒酶阳性率分别为20%和88.1%，8例鼻咽纤维血管瘤均未检测到端粒酶活性。鼻咽癌伴颈部淋巴结转移者端粒酶阳性率高于无颈部淋巴结转移者（P=0.035），临床晚期（III、IV）端粒酶阳性率高于临床早期（I、II） (P=0.048)，而端粒酶与鼻咽癌患者的年龄、性别及远处转移均无明显相关性（P＞0.05）。鼻咽癌患者血清EB病毒VCA/IgA阳性率明显高于鼻咽粘膜正常者（P＜0.001）。结论　端粒酶活性表达在鼻咽癌发病机制中起着重要作用。端粒酶活性结合血清EB病毒抗体的检测有利于鼻咽癌的早期诊断。

The study on the role of telomerase activity in human nasopharyngeal carcinoma

PENG Hong，WANG Xijun，YANG Guangcai（Department of Otorhinolaryngology，Nanfang Hospital，The First Military Medical University，Guangzhou 510515, China）

　　【Abstract】　Objective　To elucidate the role of telomerase activity in nasopharyngeal carcinoma (NPC).Methods　 Telomerase activity was detected using the telomere repeat amplification protocol(TRAP) combined with silver staining in 42 low-differentiated squamous carcinoma, 10 normal nasopharyngeal mucosae and 8 nasopharyngeal fibrohemangioma. Results　Telomerase activity was detectable in 20% normal nasopharyngeal mucosae and 88.1% in nPC. The activity of telomerase was not detectable in 8 nasopharyngeal fibrohemangioma tissues. Telomerase activity was present more frequently in NPC biopsies with positive lymph node metastasis than in those without lymph node metastasis (P=0.035). Furthermore, telomerase activity was observed more frequently in advanced NPC than in early stage (P=0.048). However, there was no evidence to show the relationship between telomerase activity and other clinical features, such as age, gender and distant metastasis (P＞0.05). Serum EBV marker(VCA-IgA) was observed more frequently in NPC than in normal nasopharyngeal mucosae patients（P＜0.001）. Conclusion　Telomerase activity may play a critical role in the tumorigenesis of NPC. Detection of telomerase activity combined with serological EBV markers may contribute to the screening and early diagnosis of NPC.

　　【Key words】　Nasopharyngeal neoplasms;　 Telomerase; 　 Lymphatic metastasis

　　绝大多数鼻咽癌属于低分化鳞状细胞癌，恶性程度高，容易发生淋巴结转移和远处转移，具有相当高的死亡率。因此，探索鼻咽癌的发病机制，寻找鼻咽癌早期诊断和治疗的指标至关重要。流行病学研究已证实鼻咽癌与Epstein-Barr病毒（EBV）感染及遗传、环境因素的协同作用有关。近十年来肿瘤分子生物学的大量研究表明，肿瘤的发生主要是由于癌基因激活表达或抑瘤基因失活所致。但鼻咽癌与其它常见肿瘤不同，很少发生p53、Rb、p21和VHL等抑瘤基因的突变，癌基因的突变率亦不高。新近Cheng等^［1］的研究发现，85％原发性鼻咽癌和100％复发性鼻咽癌存在端粒酶（telomerase）活性表达，同时我们的研究也证实87.5%原发性鼻咽癌端粒酶活性高表达^［2］，在以往工作的基础上，通过对鼻咽癌与鼻咽部纤维血管瘤、鼻咽部正常粘膜进行端粒酶活性的研究，旨在进一步探讨端粒酶在鼻咽癌发生、发展过程中的重要作用、对端粒酶活性检测在鼻咽癌早期诊断中的应用提供依据。

　　材料和方法

　　一、研究对象

　　收集1996年10月～1998年1月未经化学治疗、放射治疗和生物治疗、经病理确诊的60例鼻咽部新鲜组织标本。鼻咽部低分化鳞状细胞癌42例，男29例，女13例；年龄13～76岁,其中伴颈部淋巴结转移28例，伴远处转移7例。根据鼻咽癌1992分期，I期5例，II期16例，III期10例，IV期11例。10例正常鼻咽部粘膜男5例，女5例，年龄25～64岁。8例鼻咽纤维血管瘤手术标本均为男性，年龄14～25岁。一次取材约100 mg组织立即放入液氮中储存备用，其余组织送病理检查，放弃癌细胞平均每视野少于50%的标本。同时抽取静脉血检测血清EB病毒VCA-IgA，抗体滴度大于1∶20为阳性。

　　二、组织提取物的制备和端粒酶检测：采用Kim等^［3］报道的TRAP法稍加改进^［2］。进行梯度稀释检测，并应用银染法显色替代同位素法。约从40个碱基开始的间隔6个碱基的梯度扩增产物为端粒酶阳性(图1)。

　　三、统计学分析

　　全部数据由SPSS7.5进行Fisher精确概率检验和t检验。

　　结果

　　一、鼻咽癌、鼻咽部正常粘膜及鼻咽纤维血管瘤端粒酶阳性率的比较（图1）

　　端粒酶活性呈阴性反应鼻咽癌低分化鳞癌42例中有37例（88.1%）；正常鼻咽部粘膜中有2例（20%）；鼻咽部纤维血管瘤8例中均为阴性，前者与后二者两两比较均P＜0.001。

　　二、鼻咽癌端粒酶阳性率与临床病理参数的关系（表1）

　　三、鼻咽癌患者与鼻咽粘膜正常者血清EB病毒VCA-IgA阳性率的比较

表1　 颈部淋巴结转移、临床分期、远处转移及

　　性别与鼻咽癌端粒酶表达的关系

　　端粒酶活性与年龄无关(独立样本t检验，P=0.07)

M PBR322 DNA/Hae III 标记物

　　1. 裂解缓冲液为空白对照

　　2. 鼻咽纤维血管瘤组织端粒酶活性呈阴性

　　3. 鼻咽部正常粘膜端粒酶活性呈阴性

　　4. 鼻咽部低分化鳞状细胞癌组织提取液经RNase处理后为阴性对照

　　5. 鼻咽部低分化鳞状细胞癌组织端粒酶活性呈阳性

　　6. 鼻咽部正常粘膜端粒酶活性呈阳性

　　7. Hela细胞端粒酶活性呈阳性，作为阳性对照

1　鼻咽部组织端粒酶活性检测结果

　　鼻咽部低分化鳞状细胞癌42例中血清EB病毒VCA-LgA抗体阳性34例（81.0%）；正常鼻咽粘膜10例VCA-IgA抗体阳性1例（10.0%）二者比较P＜0.001。

　　四、鼻咽癌患者血清EB病毒VCA-IgA 阳性率与组织端粒酶阳性率的比较

　　鼻咽癌42例中血清EB病毒VCA-IgA阳性34例中29例端粒酶活性呈阳性反应（85.3%），血清EB病毒VCA-IgA阴性8例中端粒酶活性全部为阳性反应，二者比较差异无显著性（P= 0.564）。

　　讨论

　　端粒酶是人类至今发现的唯一具有逆转录酶活性的核糖核蛋白复合体，它能识别染色体端粒3′的引物位点，依靠逆转录机制以自身RNA为模板重复复制端粒序列，对维持染色体稳定性和完整性起着重要作用。研究表明端粒酶在人类绝大多数恶性肿瘤发生、发展过程中起着重要作用^［4，5］。

　　一、端粒酶活性表达在发病机制中的作用

　　本实验中88.1%鼻咽癌可检测到端粒酶活性，这与文献报道^［1，6］的结果一致。在42例原发性鼻咽癌中，伴颈部淋巴结转移的鼻咽癌组织端粒酶阳性率(96.4%)高于不伴颈部淋巴结转移者(71.4%)，表明端粒酶活性表达与鼻咽癌颈部淋巴结转移有关(P=0.035)。这与Cheng等^［1］的研究结果一致。另一方面，临床晚期(III、IV期)端粒酶阳性率(100%) 高于临床早期(I期、II期)病例(76.2%)，提示端粒酶活性可能与鼻咽癌的临床进程有关，这与Cheng等^［1］的研究结果不同，我们分析可能与采用的临床分期方法不同有关。本实验结果表明端粒酶活性可能与鼻咽癌颈部淋巴结转移和肿瘤侵袭发展有关。

　　另外，鼻咽癌端粒酶阳性率明显高于鼻咽血管纤维瘤(0%, P＜0.001)及鼻咽部正常粘膜(20%, P＜0.001)，通过对鼻咽部最常见良、恶性肿瘤端粒酶阳性率的比较，我们从另一侧面证实端粒酶活性表达可能是鼻咽癌的一种普遍现象，在鼻咽癌发生、发展过程中端粒酶对肿瘤细胞恶性状态的维持可能起着重要作用。

　　二、联合检测的临床意义

　　血清EB病毒VCA-IgA检测已广泛应用于鼻咽癌的普查和早期诊断。本实验鼻咽癌患者血清EB病毒VCA-IgA检测的阳性率(81%）明显高于正常鼻咽部粘膜者(10%,P＜0.001)，这与以往的研究结果一致，又一次证明EB病毒感染与鼻咽癌的发生密切相关。通过对血清EB病毒VCA-IgA抗体滴度与鼻咽癌组织端粒酶活性检测结果的比较发现，42例鼻咽癌均可检测到端粒酶活性和/或血清EB病毒VCA-IgA(其中VCA-IgA阳性而端粒酶阴性者5例，端粒酶阳性而VCA-IgA阴性者8例，两项检测均为阳性者29例)，由于以往血清EB病毒VCA-IgA或组织EB病毒DNA的多原酶链反应检测仅限于部分伴EB病毒感染的鼻咽癌，无EB病毒感染的鼻咽癌血清VCA-IgA或组织EB病毒DNA的检测均为阴性。然而，无论是否伴有EB病毒感染，85%～88.1%的鼻咽癌都能检测到端粒酶活性，因此，在鼻咽癌诊断方面，我们认为端粒酶活性检测将是对以往血清EB病毒抗体测定的一种有效补充，端粒酶活性结合血清VCA-IgA的检测可能有利于鼻咽癌的早期诊断。由于血清EB病毒VCA-IgA滴度的改变与肿瘤的转归、复发有关，而端粒酶活性在肿瘤极早期的微小病灶已有表达，而且100%复发性鼻咽癌可检测到端粒酶活性，因此我们认为端粒酶活性结合血清VCA-IgA的检测可能更有利于鼻咽癌微小残留病灶的早期发现和肿瘤复发的早期预测。我们准备在这方面进行深入研究，以期对鼻咽癌复发的早期诊断提供一项有效的检测指标。

　　通信作者：彭宏(Email:penghong@fimmu.edu.cn)

参考文献

　　1，Cheng RY, Yuen PW, Nicholls JM, et al. Telomerase activation in nasopharyngeal carcinomas. Br J Cancer, 1998, 77: 456-460.

　　2，彭宏，白庆生，董为人，等. 鼻咽癌组织端粒酶活性的表达. 第一军医大学学报, 1998, 18: 227.

　　3，Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994, 266: 2011-2015.

　　4，Shay JW, Bacchetti SA. Survey of telomerase activity in human cancer. Eur J Cancer,1997, 33: 787-791

　　5，Holt SE, Shay JW. Role of telomerase in cellular proliferation and cancer. J Cell Physiol, 1999, 180: 10-18.

　　6，陈小君，陈巧伦，黄奕俊，等. 鼻咽癌组织端粒酶活性的研究. 癌症, 1998, 17: 328-330.

（收稿日期：1999-12-27）