前列腺癌基因p16的表达与肿瘤生物学行为的关系
第四军医大学学报1999年第20卷第8期
刘荣福 邵国兴 王禾 陈宝琦 刘凡
摘 要 目的： 探讨抑癌基因p16的表达与前列腺癌发生、发展的关系，从而从翻译水平研究p16基因与前列腺癌生物学行为的关系.方法： 采用免疫组织细胞化学SABC染色法技术、兔抗人p16多克隆抗体(C-20)和组织抗原修复技术（Sanyo eM-715FW微波炉的“慢速烹调、高火力档”15′）对41例前列腺癌标本进行检测p16基因蛋白的表达.结果： ①在41例前列腺癌组织标本中，蛋白的阳性表达率(为48.8％)较高,提示p16基因的突变或缺失可能在前列腺癌的发生发展中具有重要作用. sABC法免疫组化的结果表明，p16蛋白均表达在前列腺癌腺上皮细胞的细胞质中，大部分呈弥漫均匀分布，部分呈区域性表达.②p16基因蛋白低表达是病理分级高(恶性程度高)、具有侵袭性前列腺癌的重要特征，是其晚期事件. p16基因蛋白表达率在病理Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ级分别为80％, 47.4％, 25％，差异显著(P＜0.05)；在局限于前列腺包膜内的A+B期为65.4％，侵袭包膜外及扩散、转移的C+D期为20％，差异显著(P＜0.05)；在死亡组为12.5％，存活组为61.5％，差异显著(P＜0.05)，预示检测p16蛋白可作为判断前列腺癌预后的一个指标.结论：p16基因与前列腺癌的发生、发展密切相关；参与前列腺癌的自然病程；p16蛋白的检测是判定前列腺癌预后的一个有用的指标.为进一步研究前列腺癌的发病机理、开展新的基因疗法及制备新的抗癌药物提供了实验依据和材料.
关键词：前列腺 肿瘤 p16基因
0 引言
p16基因于1994年由Kamb等［1］和Nobori等［2］同时发现，位于人类染色体9p21.1993年Serrano等［3］发现并分离了p16蛋白，而1994年又证实它即是多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1, MTS1)的表达产物，并证实其作为细胞内抑制增殖系统成分（CKIs）直接参与细胞周期的调控，这也是p16基因的抑癌机理.细胞内存在促增殖系统成分（CDK）和抑制增殖系统成分（CKIs），两者不平衡均可导致细胞的癌变［4］.当p16基因由于突变而不能正常表达时，可使细胞增殖失去控制，向癌变发展［5］.我们采用免疫组织化学SABC方法， 探讨p16基因与前列腺癌的关系.
1 材料和方法
1.1 标本情况 41例前列腺腺癌组织标本分别来自兰州军区总医院(22例)、唐都医院(9例)、西京医院(7例)和沈阳202医院(3例).所有标本均经常规福尔马林液固定，石蜡包埋，5 μm连续切片(载玻片均经过处理并涂有防脱片的APES胶)，备染.其中,每例标本切片1张行常规HE染色，以便复诊及确诊；1张行免疫组化SABC法染色.
1.2 前列腺癌的诊断标准 前列腺癌的病理分级采用Bǒcking(1982)的三级标准［6］,临床分期采用吴阶平主编泌尿外科标准［7］分为A， b， C， D 4期.
1.3 临床资料 41例前列腺腺癌患者年龄在47岁～78岁，平均67.8岁.其中有30例为前列腺摘除标本(包括有15例为前列腺偶发癌标本)，11例为前列腺穿刺组织标本.病理分级：Ⅰ级10例(占24.4％)，Ⅱ级19例(占46.3％)和Ⅲ级12例(占29.3％).临床分期：A期15例(占36.6％),B期11例(占26.8％),C期11例(占26.8％)和D期4例(占9.8％).包括盆腔淋巴结转移、骨髓转移、肺转移及直肠侵犯各1例.随访：有21例患者获得随访，时间分别为1 a～6 a. 有8例患者死于肿瘤，其中，最长存活6 a；2例生存在3 a～4 a间死亡，其余5例均存活时间不足3 a.在余下13例仍存活的患者中，目前有1例存活已超过5 a，3例存活时间在3 a～5 a，9例目前尚不足3 a，9例中有2例在术后2 a出现广泛的转移.综上所述，存活时间不足3 a的有5例患者，存活时间超过3 a的有7例患者，余9例患者患病时间尚短.
1.4 免疫组织化学 采用SABC法，用兔抗人p16多克隆抗体(C-20)检测前列腺癌p16蛋白的表达. sABC试剂盒(SA1010)购自武汉博士德生物工程公司.操作步骤按说明书进行, 其中, 组织抗原修复采用Sanyo EM-715FW微波炉的“慢速烹调、高火力档”15.应用DAB显色，树脂胶封片.采用已知阳性的膀胱移行上皮细胞癌切片作阳性对照，采用正常兔血清代替兔抗人p16多克隆抗体作阴性对照.
1.5 结果判定 OLYMPUS-1型显微镜下双盲法阅片. p16蛋白阳性显色为棕黄色细颗粒. 参考国外文献［8］：按染色强度分为3级即0级：染色阴性；1级：用×100倍放大可清晰辨认染色；2级：用×40倍放大可清晰辩认染色.又按染色数量分为4级即0级：细胞无染色；1级：染色细胞数少于1/3；2级：染色的细胞数少于2/3；3级：染色细胞数多于2/3.将染色强度和染色数量的级数相加，大于4者即为p16蛋白阳性染色.
统计学方法： 资料处理所用的统计学方法均采用χ2检验计算.
2 结果
在41例前列腺癌组织标本中，有p16蛋白阳性表达20例，阳性率为48.8％；表现为棕色细小颗粒，全部位于胞浆中，多呈弥漫均匀分布，部分为区域表达.4例前列腺增生组织均为阴性. p16蛋白表达与前列腺癌病理分级、临床分期、患者预后的关系，详见Tab1. 结果表明：p16蛋白阳性表达与前列腺癌的病理分级有密切关系（P＜0.05），尤以Ⅰ～Ⅲ级间最为明显；p16蛋白阳性表达与前列腺癌临床分期有密切关系（P＜0.05）；p16蛋白产物阳性表达与前列腺癌患者预后关系密切（P＜0.05）.
表1 p16蛋白表达与前列腺瘤病理分级、临床分期、患者预后的关系Tab 1 Correlation between p16 expression and pathological grade or clinical staging or prognosis
| Item |
n |
Prostatic carcinoma |
| + |
- |
| Grade |
|
|
|
| Ⅰ |
10 |
8 |
2 |
| Ⅱ |
19 |
9 |
10 |
| Ⅲ |
12 |
3 |
9 |
| Staging |
|
|
|
| A+B |
26 |
17 |
9 |
| C+D |
15 |
3 |
12 |
| Prognosis |
|
|
|
| Survival |
13 |
8 |
5 |
| Death |
8 |
1 |
7 |
Grade： χ2=6.632, p＜0.05. Ⅰ～Ⅱ：χ2=1.688, p＞0.05; Ⅰ～Ⅲ： χ2=4.538, p＜0.05; Ⅱ～Ⅲ：χ2=0.752, p＞0.05; Staging： χ2=6.13, p＜0.05; Prognosis： P＜0.05.3 讨论
抑癌基因p16，即MTS1.位于人类第9号染色体(9p21)上，由3个外显子和2个内含子组成，其编码的蛋白分子质量为16 ku，故称为p16基因.它是第一个将抑癌基因的抑制肿瘤的功能直接与细胞周期调控联系在一起的抑癌基因，它的发现和研究具有极其重要的意义.
目前研究结果表明，细胞周期失控是癌变的重要原因［4］.细胞作为机体最小的生命单元，其生长过程是处于一种增殖与抑制增殖的动态平衡之中，促进增殖系统成分的过度表达或抑制增殖系统成分的缺失都会导致细胞增殖失控，向癌变发展.细胞周期受一组叫细胞周期素(cyclin)的蛋白质正性调控［9］. cyclin目前共发现8种，它们是胞内的促增殖系统成分，通过在不同的细胞周期与相应CDK结合，促进细胞完成周期；CDK的抑制蛋白，如p16蛋白，是细胞内抑制系统成分，对细胞周期起一种负性调控作用［10］.
G1期是细胞周期的起始阶段，控制细胞生长，决定细胞命运的阶段，所以，调节G1→S转换的Cyclins对细胞增殖具有最重要的意义. cyclin D可以与CDK2，4，6相结合，形成蛋白激酶复合物，促进G1→S转换，从而促进细胞生长分裂，并且可能是肿瘤发生的主要因素，尤其是Cyclin d1，其本身即被视为是一种癌基因［11］. Cyclin D1是控制G1期进入S期的关键因子，起正调节作用. p16蛋白是G1关卡的主要负调节因子［12］. p16蛋白是CDK4的抑制蛋白，能特异地抑制CDK4的活性，使之不能解除Rb基因对转录因子的抑制，从而阻止G1→S转换，抑制细胞分裂.
p16与CDK4结合是竞争性，通过与Cyclin D竞争结合CDK4，抑制Cyclin d/CDK4复合物的活性，从而抑制细胞的分裂和恶性转换［3］.当p16由于MTS1突变或缺失而不能正常表达时，一方面不能竞争地结合CDK4，导致CDK的过度作用，pRb磷酸化而抑制作用被解除；另一方面增加Cyclin d与CDK4结合，进一步刺激细胞分裂，从而使细胞失去控制，向癌变发展.
p16基因的突变和缺失在人恶性肿瘤中普遍存在，包括胰腺癌、神经胶质瘤、食管癌、肺癌等，突变率在30%～80%左右. liu等［10］检测了154种不同肿瘤的细胞系得出类似的结果.目前有关前列腺癌的研究尚少见报道.
本研究结果表明，抑癌基因p16蛋白的阳性表达率在前列腺癌标本中较高(约50％左右).提示p16基因的突变或缺失可能在前列腺癌的发生发展中具有重要作用. sABC法免疫组化结果表明，p16蛋白的阳性表达均位于前列腺癌腺上皮细胞胞浆中(Fig1).
图1 前列腺癌细胞质中p16蛋白呈阳性Fig 1 p16 positive substance in the cytoplasm of prostate cancer cells SABC ×400
本研究结果表明：p16蛋白低表达是病理分级高(恶性程度高)，具有侵袭性前列腺癌的重要特征，是其晚期事件. p16蛋白表达与前列腺癌患者的病理分级、临床分期及预后密切相关.本组病理Ⅰ级p16蛋白表达均明显高于病理Ⅱ， Ⅲ级(P＜0.05)；偶发癌及病变局限在前列腺包膜的A+B组p16蛋白表达均明显高于肿瘤侵犯包膜外及扩散、转移的C+D组(P＜0.05)；存活组的p16蛋白表达均明显高于死亡组(P＜0.05).表明恶性程度低、早期的肿瘤p16蛋白表达高于恶性程度高、有侵袭性的晚期肿瘤. p16蛋白具有抑制肿瘤细胞分裂和恶性转化的作用.本组实验结果与姚宏等［13］报道不相符合，其原因有待于进一步研究.但与袁建林等［14］， 平季根等［15］及孔垂泽等［16］相符合.
总之，抑癌基因p16参与前列腺癌的发生发展，自然病程及预后；抑癌基因p16的突变或缺失可能是前列腺癌侵润、转移的重要原因之一，p16蛋白可作为前列腺癌患者的预后指标，但还需大系列病例的长期随访观察.
前列腺癌的产生、发展过程肯定与多种癌基因、抑癌基因有关，本实验仅研究p16基因蛋白表达与前列腺癌的分化程度，自然病程及预后的关系.多基因间的相互作用关系将是进一步进行研究的工作.
作者简介:刘荣福，男，1969-10-30生，福建省长泰县人，汉族.1992年第四军医大学医疗系毕业. 1997年该校外科学（泌尿外科）硕士毕业，博士生，医师. 发表论文10余篇. 电话：（029）3577138
作者单位：刘荣福 刘 凡 第四军医大学唐都医院泌尿外科，陕西西安 710038
邵国兴 王 禾 陈宝琦 第四军医大学西京医院泌尿外科
参考文献
1 Kamb A, Gruis NA, weaver-Feldhans J et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science，1994;264(5157):436-440
2 Nobori t, Miura K, Wu DJ et al. Deletions of the cyclindependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers. Nature， 1994;368(6473):753-756
3 Serrano m, Hannon GJ, Beach DA. A New regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature， 1993;366(6456):704-707
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12 Bonetta L. Tumor-suppressor genes: open questions on p16. Nature，1994;370(6486):180
13 姚 宏，邢惠清，平苏萍et al. 抑癌基因p16蛋白产物在前列腺癌中的表达.中华泌尿外科杂志， 1996；17(12)：730
14 袁建林，王剑波，于茂生et al. 抑癌基因p16在膀胱肿瘤中的表达及意义.中华泌尿外科杂志，1995；16(12)：722-724
15 平季根，郭震华，陈赐龄et al. 抑癌基因p16在膀胱移行细胞癌中表达的意义.临床泌尿外科杂志， 1997；12(1)：36-38，53
16 孔垂泽，李光伟，刘同才et al. 肾盂输尿管癌中抑癌基因p16的表达及临床意义.中华泌尿外科杂志，1997；18(2)：70
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