前列腺癌微小转移的临床检测——高灵敏度的分子生物学新指标

　　国外医学临床生物化学与检验学分册1999年第20卷第1期

　　南开大学分子生物学研究所（天津300071）

　　赵洪^①张琚^② 于自然冯剑利

　　摘要如何准确地诊断前列腺癌的癌变程度，一直是困扰临床医师的重要问题。本文介绍了目前在国际上尚处于研究阶段的新的分子生物学检测方法。即用 rT-PCR技术，在患者外周血中检测前列腺特异性抗原的 mRNA，以监测前列腺癌细胞的微小转移。

　　关键词：前列腺癌； rT-PCR；前列腺特异性抗原 mRNA

　　1992年 moreno jG等首次报道了在分子生物学水平上前列腺癌进行分期的新技术，即用 rT-PCR方法以 pSA的 mRNA为标志检测前列腺癌的微转移^[1]。据报道，常见的前列腺癌骨转移就是肿瘤细胞经血液转移的结果^[2]。 pSA是前列腺组织特异表达的抗原，在外周血液中检测出 pSA的 mRNA说明其外周血中存在着前列腺癌细胞，即竟未着前列腺肿瘤细胞发生了微转移。此项技术一经问世，引起了泌尿界广泛的关注，并且在深入研究 pSA mRN指标在前列腺癌诊断和治疗方面价值的同时，积极寻找其它的前列腺器官特异性抗原，以期筛选出较为理想的分子生物学指标。

　　1前列腺癌转移的分子生物学检测指标

　　1.1 PSA mRNA目前大多数研究者认为应用 pSA mRNA指标对测定前列腺癌患者的微转移有极高的灵敏度和特异性，如经病理学检查证实已发生转移的患者，其外周血中 pSA mRNA的阳性检出率可达到80%以上^[3，4]；用同样的方法也可检出临床诊断为局限癌而发生微转移的病人，对其放射状前列腺切除样品的分析表明，检测的阳性结果与前列腺被囊外浸润高度相关，而且，其手术后复发的风险相对于 pSA的 mRNA阴性病人高3.6倍^[5]。对健康男性、前列腺良性增生患者和女性检测的结果则均为阴性^[3～6]。在前列腺癌转移至淋巴结的组织中检测前列腺细胞，用 rT-PCR方法比用免疫组化的方法具有更高的灵敏度^[4]；有前列腺癌转移至骨髓的组织中用 rT-PCR方法检测的阳性结果与其病理分期高度相关^[7，8]。这些事实初步证实了 pSAmRNA指标在前列腺癌分期、疗效监测及预后分析方面有着重要的临床意义。但也有少数的研究者报道，在此检测方法的灵敏度提高到一定程度后会使其特异性降低，以至于在女性及健康男性的外周血中也检测出了 pSAmRNA的阳性表达^[9，10]，产生这种相反研究结论的因素和原因，有待进一步的探讨。

　　1.2 hK-2 mRNA除了 pSA为最广泛研究的前列腺特异性标志物外，1996年 charles y.F.Young又提出了采用人体前列腺特异的人类激肽释放酶2（ human kallikrein, Hk2）作为检测前列腺癌的新指标^[11]。 hK2同 pSA一样是人类激肽释放酶家族的成员^[12]。1987年首次发现了编码 hK2的基因（ hKLK2）^[13]，并于1992年克隆出其 cDNA^[14]。组织免疫学研究证实 hK2也主要在前列腺的上皮细胞中表达，并且依赖于雄激素的调节，但是两者启动子的顺序完全不同^[15]，推测在鞭表达的调控上会有差异。另外 hK2和 pSA在一级结构上虽有79%的氨基酸相同，但 hK2具有类胰蛋白酶的活性，而 pSA却具有类糜蛋白酶活性^[16]。更令人感兴趣的是，有资料证实，在体外 hK2能将前体 pSA（ pro-PSA）转化为成熟的、具有酶活性的 pSA，并据此推测在体内 pSA的活性可能也受 hK2调节^[17]。用免疫学的方法证实， hK2表达的强度，在癌细胞、上皮内非典型增生（ pIN）细胞和良性上皮细胞中依次递增。 charles Y.F.Young在同一组前列腺癌转移病人的外周血中检测 hK2的 mRNA，其阳性率为67%，而 pSA的 mRNA阳性率为17%^[11]。 hK2 mRNA是否可以成为灵敏度和特异性更高的前列腺癌检测指标，或与 pSAmRNA的指标相互补充应用于临床检验值得进一步研究。

　　1.3 PSM mRNA近来，一个前列腺肿瘤的特异性抗原即前列腺特异的膜抗原（ pSM）引起了人们的极大关注，据报道在其基因的转录中可因剪接方式的不同产生相关266个核苷酸的两种 mRNA分子，其分子量较大者编码一种跨膜糖蛋白，分子量较小者编码一种可溶性的非膜蛋白（被称为 pSM’），在正常的前列腺细胞中 pSM’的表达占优势，在前列腺肿瘤细胞中 pSM的表达占优势，推测其在前列腺细胞的恶性转化过程中可能起一定的作用。应用 rT-PCR的方法定量分析前列腺细胞中 pSM mRNA和 pSM’mRNA表达比例的变化，将有助于对前列腺癌的诊断、分期和预后。而且 pSM作为靶分子可为前列腺肿瘤的免疫学治疗提供新的途径。

　　2 RT巢式 pCR检测的原理

　　抽取患者外周静脉血，用 ficoll淋巴细胞分离液分离出单核细胞，用异硫氰酸胍-酸苯酚法提取细胞中的总 rNA，经反转录酶催化合成 cDNA，以此 cDNA作为模板，应用巢式 pCR技术扩增欲测基因的 mRNA，即用与前列腺特异性抗原基因序列相匹配的一对寡核苷酸作引物，在 dNA聚合酶作用下，进行第一次 pCR的扩增，再以第一次 pCR的扩增产物作为模板用与以上引物内侧基因序列相匹配的另一对寡聚核苷酸作为引物，进行第二次 pCR，将被检测信号再次放大，以提高前列腺特异抗原 mRNA检测的灵敏度。目前，用此方法以 pSA的 mRNA为标志检测前列腺癌细胞的灵敏度可达到10^8[3]（即在10⁸个不表达 pSA mRNA的细胞中有一个前列腺癌细胞即可被检出）。而且，目前除对前列腺癌患者外周血样进行前列腺癌细胞的检测外，也可对前列腺癌转移的淋巴结和骨髓样品进行检测。

　　3结语

　　肿瘤转移的发生是一个多步过程，检测出患者外周血中存在有肿瘤细胞，仅能说明这部分患者有发生转移的倾向，并不能确定患者是否真正会发生前列腺肿瘤的转移。因素，进一步将其 pCR产物定量，确定前列腺癌发生转移时患者外周血中前列腺特异抗原 mRNA表达的临界值，具有更重要的临床意义。

　　参考文献

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