维甲酸诱导前列腺癌细胞DU-145凋亡有关的基因克隆

　　第四军医大学学报2000年第21卷第6期

邵晨　朱峰　晏伟　赵忠良　柴玉波　王成济　邵国兴

　　摘　要： 目的　克隆维甲酸诱导的前列腺癌细胞DU-145凋亡的未知相关基因.方法　以全反式维甲酸（all-trans retinoic acid）诱导前列腺癌细胞系DU-145细胞凋亡，在此基础上，采用基于PCR技术的改良消减杂交方法克隆前列腺癌凋亡相关基因.结果　成功克隆出一条与凋亡可能有密切关系的未知基因pcar，已被GenBank收录，登录号为AF174394.结论　维甲酸诱导前列腺癌细胞DU-145凋亡的过程是一个多基因参与的复杂过程，pcar可能是参与这一过程的基因之一.

　　关键词：前列腺癌；凋亡；维甲酸；克隆

　　0　引言

　　细胞凋亡是细胞的一种主动死亡方式，它与细胞的增殖活动一道，共同调节生物的生命活动^［1］. 凋亡是一个受遗传调控的自身编码死亡方式，涉及许多基因的共同作用^［2］，这些基因中仍有相当一部分是未知的. 因此，对于这些未知凋亡基因的克隆，有助于人们进一步认识凋亡这一生命活动，对揭示一些疾病的发生、发展有着重要意义. 我们通过以全反式维甲酸（ATRA）诱导前列腺癌细胞系DU-145细胞凋亡^［3］，建立细胞模型，应用基于PCR技术的改良消减杂交法，克隆与凋亡有关的新基因，这种经过改良的克隆基因方法，与原来的方法相比，操作步骤大大简化，而实验结果可能更为理想.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　前列腺癌细胞系DU-145细胞由美国MD Anderson cancer center 分子生物学实验室提供，Bluescripe KS, DH5α由本校生物化学和分子生物学教研室保存. RPMI 1640(Gibco), All Trans-Retinoic Acid(Sigma)，Poly AT tract System-1000 kit (Promega) , Klen Taq LA Polymerase (Clontech)，Nucleo Trap Gel Extraction kit (Clontech)，柱离心式质粒（小量）抽提纯化试剂盒（上海华舜生物工程有限公司）.

　　1.2　方法

　　1.2.1　细胞模型的建立　将处于对数生长期的DU-145细胞分为实验组、对照组两组，每组含1×10⁶个细胞，在实验组中加入10 μL 10^-2 mol·L^-1 ATRA（溶于无水乙醇），使培养液中ATRA终浓度为10^-5 mol·L^-1，对照组加入10 μL无水乙醇，培养液中小牛血清浓度为130 mL·L^-1，培养36 h，收集细胞.

　　1.2.2　提纯mRNA　应用Promega Poly AT tract system 1000试剂盒，提纯mRNA.

　　1.2.3　制备cDNA　实验组细胞mRNA用SMART^TM PCR cDNA synthesis kit(clontech)进行反转录，将试剂盒中的3′引物“T₃₀（A/G/C）（A/G/C/T）”替代为3′锚定引物TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAAT30（A/G/C）（A/G/C/T），该引物与“cap-finder” 引物前24 nt是一样的，其目的在于以后只用一条引物来扩增cDNA. 对照组细胞mRNA按常规进行反转录，以T18及10-mer随机引物R进行PCR，扩增产物作为杂交探针. 将3 μL实验组cDNA与100 μL杂交探针进行杂交，杂交16 h.

　　1.2.4　差异cDNA模板的获得　将杂交液加到Sephacryl S-400 spin column (Promega)，离心收集液体，将上述液体加到0.1 mL streptavidin magnesphere paramagnetic particles(Promega)中，37℃结合2 min，65℃温育5 min，减少非特异性杂交，在磁场作用下分离出上清作为PCR模板.

　　1.2.5　差异片段的获得与克隆　由于差异cDNA模板在反转录时其两端已偶联上引物序列，因此可直接用PCR将其扩增出来. 将PCR产物沉淀，重新溶解于20 μL H₂O中，加入PCR Buffer，100 mmol·L^-1 dATP 1 μL, Taq酶4 μL 于72℃，反应1 h，此后进行15 g·L^-1 Agarose电泳分离，用核酸胶回收试剂盒（Nucleo Trap Gel Extraction kit clontech）回收0.6～1.5 kb的片段，以T vector常规方法进行连接，转化，并挑选白色克隆，摇菌.

　　1.2.6　质粒的提取及鉴定　应用柱离心式质粒（小量）抽提纯化试剂盒提取质粒，用EcoRⅠ及HindⅢ进行插段鉴定，选取有插段的质粒. 以对照组cDNA为模板，用PCR方法制备探针. 反向点杂交方法鉴定有插段的质粒，选取阳性克隆，杂交时设立阴性和阳性对照.

　　1.2.7　序列分析　纯化所选取的克隆，按说明进行测序反应，测定序列，正向测序完成后，进行BLAST比较，无同源性的序列再进行反向测序. 使用计算机软件PC/GENE 6.60版，并通过国际互联网（internet）利用NCBI Genbank和SWLSS-PROT ProDom数据库对所测得的基因进行：核酸及蛋白序列同源性分析（BLAST），基因片段的编码区分析，局部组成复杂性分析（Local composition complexity Lcc）.

　　2　结果

　　含有差异cDNA插段克隆的鉴定结果：选取鉴定大小在0.6～1.5 kb插段的克隆，较长片段的鉴定准备后续完成. 随机挑选16个白色克隆，鉴定出其中10个含有插段，Fig 1为部分克隆的酶切鉴定图（EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切）.

图 1　部分克隆的酶切鉴定图

　　Fig 1　Identification of clones with inserted fragments by restriction enzymes digestion

　　A:DNA/EcoRⅠ & HindⅢ marker；B-J:white clones；H:clone of No.3.

　　反向Southern点杂交结果：将10个含有插段的克隆点膜，进行反向杂交，探针为对照组的PCR产物，杂交后放射自显影(Fig 2)，共有4个杂交阳性信号，右上方为阳性对照.

图 2　反向杂交后放射自显影图，右上角为阳性对照

　　Fig 2　Identification of flase positive clones by reverse dot bloting, the right-up dot is positive control

　　序列测定及BLAST初步分析结果：将6个克隆以正向引物为测序引物，测序后进行计算机分析，其中3号克隆有可能为新基因，其余多为TNF, c-erbB-2等已知基因. 对3号克隆进行反向测序并进行拼接，可以接成完整序列(Fig 3). 利用internet对其核酸序列进行BLAST分析(Tab 1)，局部组成复杂性(LCC)分析，读框分析及推导其蛋白质序列（Fig 4），并命名为pcar，登录入Genbank, 登录号为AF174394.

　　3　讨论

　　3.1　关于细胞模型　维甲酸是一类与维生素A结构相似的天然或合成物质，最早临床用于白血病的治疗，并认为其具有调控生物细胞增殖、分化的作用. 近年来，人们发现其对前列腺癌细胞的生长也有双向性的影响，Fong等^［4］以ATRA作用于前列腺癌细胞LNCaP, 当浓度为10 μmol·L^-1时，细胞生长明显受抑制并出现凋亡，而作用浓度降至0.1 μmol·L^-1则促进细胞生长，这种作用和维甲酸的作用浓度关系密切. 同时，维甲酸对抗表皮生长因子EGF和TGF-α对前列腺癌细胞的促生长作用，加强了TGF-β对前列腺癌细胞生长的抑制作用，并且与去氢睾酮共同影响前列腺癌细胞分泌PSA的能力. 而维甲酸受体已证实为类固醇/甲状腺激素样受体家族成员之一^［5］，它与雌激素对前列腺癌细胞的作用有类似之处^［6］. 同时维甲酸可以使前列腺癌细胞的细胞核受体基因hRxR-alpha的表达升高，使细胞代谢发生改变^［7］. Esquenet等^［8］也发现，前列腺癌的生长与分化，不但受雄激素与生长因子的调控，RA及VD₃等也参与调控. 高浓度维甲酸可以导致体外前列腺癌细胞凋亡已被广泛实验证实，但对于维甲酸在人体内对前列腺癌的影响尚存争议. 我们曾应用ATRA（10^-5 mol·L^-1）作用DU-145细胞48 h，发现细胞形态改变明显，伪足消失，细胞变圆，胞内颗粒增多，流式细胞仪出现凋亡峰（2.4%），考虑到基因水平的改变往往应在细胞形态发生变化之前，因此选择在形态改变尚不显著的作用36 h（有关文章在整理中），这是一个折中的选择，未必是最佳的时间点.

图 3　3号克隆完整核酸序列

　　Fig 3　Whole nuclear acid sequence of clone No.3

表 1　基因序列的BLAST分析

　　Tab 1　The rough BLAST results of sequence of clone No.3

T A A R R R E K G T A A R R R Q K G T A A R R R Q E G T A A R R R Q K G T A A R R R R G R R G G R G R R R G R R K E E G G G G K V G R G G G G E K R E K E R K K E I G K K R K K N K S R K E M S P F T C S Q P Q E K H S S I L Q L G E T Y L I S T A K I V L S R L G K T E Q V E L L L C E M F C Y Stop R P C L G Q V Stop W L Met P V I P P Q W E A E A G G S L E P R S S R P A W A T W Q N P I S T K N T T S S W A W Stop P A L V V P A T R E P E V G R S L E H G R C R L Q Stop A K S R L R H C T P A W Met T E Stop G P V S K K K K E R K K E K E K K K T Stop L Stop T H K P A G E F A L S G E T Q Stop K P S A K L Q Stop C G T I T T K S E R I K A F A L K Met Stop W Stop S Stop Y D V Met R L A L F T F V V F C S R

图 4　推导的蛋白质序列

　　Fig 4　Sequence of translated protein

　　3.2　关于克隆的未知基因　从pcar的核酸序列BLAST分析结果（Tab 1）来看，它与目前的已知序列同源性极低，同时，我们利用计算机软件PC/GENE 6.60版对其进行局部组成复杂性分析，证明其编码区的LCC值曲线平缓，接近于1，相对于非编码区要高出许多，推导的蛋白质序列发现其有可能编码145个氨基酸（Fig 4），而PDB蛋白库比较未发现其有同源蛋白，上述LCC分析及读框分析结果，说明pcar可能编码一未知蛋白. 我们实验中克隆出大量肿瘤坏死因子及c-erb B-2基因，而这两者均与凋亡关系密切，结合实验设计的“靶向性”较好，说明pcar有可能为一个与凋亡有密切关系的新基因，最后结论尚有待进一步实验证实.

　　3.3　关于克隆基因方法的改进　传统的DD-PCR技术工作量很大，得到的片段较小，而且片段在编码区内的几率小，假阳性率也高，最高可达80%，因而工作效率低. 而消减杂交技术同样步骤烦琐，工作量大，假阳性率高，而且对于低丰度的基因不能进行有效克隆^［9］. 我们所采用的由赵忠良士首创的基于PCR的消减杂交方法是建立在Cap-finder技术，LD-PCR Biotion-dNTP，磁性分离系统及Sephacryl离心柱分离技术等多种新技术手段之上，在很大程度上解决了上述问题，它简化了实验步骤，减少了假阳性率的发生，对低丰度基因的克隆效果有很大提高，而且得到的序列多在编码区内. 这种新方法为克隆新基因提供了一个有意义的新的尝试.

　　作者简介：邵　晨（1969-），男（满族），广东省南海县人. 博士生（导师邵国兴，王成济）,住院医师. Tel.(029)3375624　Email.Shaochen@pub.xaonline.com

　　邵晨（第四军医大学：西京医院泌尿外科，陕西 西安 710033）

　　朱峰（第四军医大学：基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033）

　　晏伟（第四军医大学：基础部病理学教研室，陕西 西安 710033）

　　赵忠良（第四军医大学：基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033）

　　柴玉波（第四军医大学：基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033）

　　王成济（第四军医大学：基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033）

　　邵国兴（第四军医大学：西京医院泌尿外科，陕西 西安 710033）

　　参考文献：

　　［1］ Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis a basic biologiphenomenon with wide-raging implications in tissue kinetics［J］. Br J Cancer, 1972;26(4):239-257.

　　［2］ Ellis RE, Yuan JY, Horvitz. Mechanisms and functions of cell death［J］. Annu Rev Cell Biol,1991;7(2):663-698.

　　［3］ Shao ZM, Dawson MJ, Xiao SL et al. P53-independent Go/G, arest and apoptosis induced by a novel retinoid in human breast cancer cells［J］. Oncogene, 1995;11(3):493-505.

　　［4］ Fong CJ, Debra M, Sutkowski et al . Effect of retinoic acid on the proliferation and secretory activity of androgen-responsive prostatic carcinoma cells［J］. T J Urol, 1993;149(5):1190-1194.

　　［5］ Petkovich M, Brand H, Krust S et al. A human retinoic acid receptor which belongs to the family of nuclear recepors［J］. Nature, 1987;330(6147):440-450.

　　［6］ Hirose T, Kouhara H, Tomas J et al . Effect of retinonic acid on proliferation of estrogen-responsive transformed murine leydig cells in serum-free culure［J］. Caner Res, 1990;50(16):5060-5063.

　　［7］ Dahiya R, Boyle B, Park HD et al. 13-Cis-retinoic acid-mediated growth inhibition of DU-145 human prostate cancer cell［J］. Biochem Mol Biol Int, 1994;32(1):1-12.

　　［8］ Esquenet M, Swinnen TV, Heyns W et al. Control of LNCaP proliferation and differentiation:VD3 actions and interactions of andrgoens, l alpha. 25-dihydvoxy cholecalciferol all trans retinoic acid, 9-cis-RA and phenylacetate［J］. Prostate, 1996;28(30):182-194.

　　［9］ 朱　峰. 参与PCR技术的缺陷与对策［J］. 生命科学，1998;10(11):37-39.