全反式维甲酸诱导前列腺癌细胞系DU-145凋亡的分子机理

　　西安医科大学学报2000年第21卷第3期

邵晨　邵国兴　王禾　陈宝琦　贺大林　秦荣良　朱峰　赵忠良

　　摘　要：目的　克隆全反式维甲酸诱导前列腺癌细胞系DU-145细胞产生凋亡的相关基因。探讨维甲酸诱导前列腺癌细胞产生凋亡的分子机理。方法　应用全反式维甲酸诱导前列腺癌细胞系DU-145细胞凋亡，采用基于PCR的改良消减杂交技术克隆与凋亡相关的基因。结果　在前列腺癌DU-145细胞凋亡过程中，有大量肿瘤坏死因子(TNF)的表达，同时，克隆出c-erb b-2基因。结论　TNF及c-erb B-2基因在由全反式维甲酸诱导的前列腺癌细胞系DU-145细胞凋亡过程中起着重要作用。

　　关键词：肿瘤坏死因子；前列腺癌；凋亡；维甲酸

　　细胞凋亡(apoptosis)是机体为了维持自身的稳定，所采取的一种积极主动的死亡方式，最初是由Kerr等人于1972年提出的^［1］。近年来，人们已经认识到细胞死亡和细胞增殖一样，是一个极其复杂而调控精确的并且有多基因参与的过程^［2］。维甲酸是一类与维生素A结构相似的天然或合成物质，临床上最早用于白血病的治疗，近来陆续有报道维甲酸能够诱导多种肿瘤细胞的凋亡,如乳腺癌^［3］、肺癌等，而维甲酸同样可以诱导前列腺癌细胞的凋亡，但目前其凋亡的分子机理尚未完全清楚。我们以全反式维甲酸(All trans retinoic acid, ATRA)诱导前列腺癌细胞DU-145凋亡，应用基于PCR的改良消减杂交技术克隆与凋亡相关的基因，以期改进目前克隆基因方法中的不足之处，同时希望进一步明确维甲酸诱导前列腺癌细胞凋亡的分子机理。

　　1　材料与方法

　　1.1　细胞系、菌株、载体　前列腺癌细胞系DU-145细胞由美国MD anderson cancer center分子生物学实验室提供，Bluescripe KS, DH5 α由第四军医大学生物化学和分子生物学教研室保存。

　　1.2　材料　RPMI 1640 (GIBCOBRL)，　All Trans-Retinvic acid(Sigma),Poly AT tract System-1000 kit (Promega),Klen Taq LA polymerase(CLONTECH),Nucleo Trap Gel Extraction kit(CLONTECH),柱离心式质粒(小量)抽提纯化试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)。

　　1.3　细胞模型的建立　将处于对数生长期的DU-145细胞分为实验组、对照组两组，每组含1×10⁶个细胞，在实验组中加入10μl10^－2mol/L ATRA(溶于无水乙醇)，使培养液中ATRA终浓度为10^－5mol/L，对照组加入10μl无水乙醇，培养液中小牛血清浓度为13%，培养36h，收集细胞。

　　1.4　实验组及对照组mRNA的提纯　应用Promega Poly aT tract system 1000试剂盒。基本原理是在异硫氰酸胍的作用下裂解细胞，加入biotin标记的oligo-dT来捕获mRNA，用偶联streptavidin的磁珠将mRNA分离出来，具体步骤详见Kit的使用说明。

　　1.5　制备实验组cDNA　实验组细胞mRNA用SMART^TM pCR cDNA sypthesis kit(clontech)进行反转录，将试剂盒中的3’引物“T₃₀(A/G/C)(A/G/C/T)”替代为3’锚定引物“TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAAT30(A/G/C)(A/G/C/T)”,该引物与“can-finder引物前24nt是一样的，其目的在于以后只用一条引物来扩增cDNA。

　　1.6　制备对照组cDNA　对照组细胞mRNA按常规进行反转录PCR，以T18及10-mer随机引物进行PCR，经多次实验确立的PCR条件为：20μmol/L biotin-21-dUTP(clontech),200μmol/L dNTP,1μg oligo-dT(15～18),90pmol 10聚随机引物1μl，1μl反转录模板，50μl反应体积；PCR参数为：95℃,20s;40℃,5min;72℃,3min;循环40次。扩增产物作为杂交探针，也称为驱动DNA。

　　1.7　杂交　将3μl实验组cDNA与100μl杂交探针进行杂交，条件为6×SSC，0.5% sDS，65℃杂交16h。

　　1.8　差异cDNA模板的获得　用下列方法除去杂交体及驱动cDNA，将杂交液加到Sephacryl s-400 spin column(Promega),离心收集液体。将上述液体加到0.1ml streptavidin magnesphere@ paramagnetic particles(Promega)(将1ml磁珠悬液用0.5×SSC洗涤3次，再悬于0.1ml0.1×SSC)中，室温结合2min，65℃温育5min减少非特异性杂交，在磁场作用下分离出上清作为PCR模板。

　　1.9　差异cDNA模板的扩增及差异片段的获得　由于差异cDNA模板在反转录时其两端已偶联上引物序列，因此可直接用PCR将其扩增出来。为了保持cDNA片段的长度，PCR用Advantage cDNA PCR kit(clontech LD-PCR)，条件为：200μmol/L dNTP,400nmol/L 引物(TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAA，与5′的帽子引物和3’的锚定引物对应)；40μl杂交分离后的上清作为模板，5μl反应体积，PCR参数为95℃15s,68℃ 5min，循环25次。

　　1.10　差异片段的克隆　①将PCR产物沉淀，重新溶解于20μl h₂O中，加入PCR Buffer, 100mmol/L dATP 1μl， Taq酶4μl于72℃，反应1h，此后进行1.5% agarose电泳分离，用核酸胶回收试剂盒(Nucleo Trap Gel Extraction kit clontech)回收0.6～1.5kb的片段。②用EcoR V酶切Bluescript ks进行类似上述反应，将dATP换为dTTP制备T vector。③用常规方法进行连接、转化，并挑选白色克隆，摇菌。

　　1.11　质粒的提取及鉴定　应用柱离心式质粒(小量)抽提纯化试剂盒提取质粒，用EcoR i及Hind Ⅲ进行插段鉴定，选取有插段的质粒。

　　1.12　反向点杂交鉴定　以对照组cDNA为模板，以10-mer随机引物及T₁₈为引物，加入含³²P-dATP的dNTP，用PCR方法制备探针。反向点杂交方法鉴定有插段的质粒，选取阳性克隆，杂交时设立阴性、阳性对照。

　　1.13　测序　纯化所选取的克隆，按说明进行测序反应，测定序列，正向测序完成后，进行Blast比较。

　　1.14　计算机序列分析　使用计算机软件PC/GENE6.60版，并通过国际互联网(internet)利用NCBI Genbank和SWLSS-PROT proDom数据库对所测得的基因进行：核酸及蛋白质序列同源性分析(BLAST)，基因片段的编码区分析，局部组成复杂性(Local composition complexity,LCC)分析等。

　　2　结果

　　2.1　消减杂交前后PCR产物的鉴定及PCR回收产物的电泳鉴定结果　在实验中，分别对实验组、对照组的cDNA模板以及对杂交后cDNA模板进行PCR，区域性回收杂交后cDNA模板的PCR产物，并对上述产物进行电泳鉴定(图1)。

图1　PCR产物电泳鉴定图

　　1～4道分别为杂交后cDNA，实验组原始cDNA，对照组原始cDNA，回收杂交后cDNA模板的PCR产物，5道为PCR Marker

　　2.2　含有差异cDNA插段克隆的鉴定结果　选取鉴定大小在0.6～1.5kb插段的克隆，较长片段的鉴定准备后续完成。随机挑选16个白色克隆，鉴定出其中10个含有插段，图2为部分克隆的酶切鉴定图(EcoR i和Hind　Ⅲ双酶切)。

图2　部分克隆的酶切鉴定图

　　a为DNA marker， B-J为随机挑选的白色克隆，H道为3号克隆

　　2.3　反向点杂交结果　将10个含有插段的克隆点膜，进行反向杂交，探针为对照组的PCR产物，杂交后放射自显影，共有4个杂交阳性信号，予以剔除。

　　2.4　序列测定及BLAST初步分析结果　将6个克隆以正向引物为测序引物，测序后进行计算机分析，其中3号为c-erb b-2基因，6号克隆有可能为新基因，6号克隆的测序工作尚在进行中。而1、2、4、5号克隆结果均为TNF，克隆1，2，3，4，5的核酸序列分析(BLAST)见表1。

表1　克隆序列的BLAST分析

　　3　讨论3.1　维甲酸对前列腺癌细胞生长的影响　维甲酸是一类与维生素A结构相似的天然或合成物质，最早临床用于白血病的治疗，并认为其具有调控生物细胞增殖、分化的作用。近年来，人们发现其对前列腺癌细胞的生长也有影响，这种影响表现为双向性的，Chan-Jye fong^［4］等以ATRA作用于前列腺癌细胞LNCaP,当浓度为10μmol/L时，细胞生长明显受抑制并出现凋亡，而作用浓度降至0.1μmol/L则促进细胞生长，这种作用和维甲酸的作用浓度关系密切。同时，维甲酸对抗表皮生长因子EGF以及TGF-α对前列腺癌细胞的促生长作用，加强TGF-β对前列腺癌细胞生长的抑制作用，并且与去氢睾酮共同影响前列腺癌细胞分泌PSA的能力。而维甲酸受体已证实为类固醇/甲状腺激素样受体家族成员之一^［5］，并且它与雌激素对前列腺癌细胞的作用有类似之处^［6］。同时维甲酸可以使前列腺癌细胞的细胞核受体基因hRXR-alpha的表达升高，并使细胞代谢发生改变^［7］。Esquenet^［8］等也发现，前列腺癌的生长与分化，不但受雄激素与生物因子的调控，RA及VC等也参与调控。体外高浓度的维甲酸可以导致前列腺癌细胞凋亡已被广泛实验证实，但对于维甲酸在人体内对前列腺癌的影响尚存争议。我们曾应用ATRA(10^－5mol/L)作用DU-145细胞48h，发现细胞形态改变明显，伪足消失，细胞变圆，胞内颗粒增多，流式细胞仪出现凋亡峰(5%)，考虑到基因水平的改变往往应在细胞发生变化之前，因此选择在形态改变尚不显著的作用36h。此为一个折中的选择，但未必是最佳的时间点。

　　3.2　肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF)及c-erb B-2基因与凋亡的关系　在实验中，我们通过随机挑选产生并经鉴定和测序的6个克隆中，其中4个测序结果证实为TNF基因。TNF是一类配体的超家族，目前该家族成员包括TNF，LT-α、Fas ligand CD40L,CD27L,CD30L等，TNF诱导凋亡是通过Caspase激活而引发细胞凋亡的，同时，大多数细胞表面有TNF-R，TNF与TNF-R结合也是TNF诱导凋亡的主要方式^［9］。通过免疫组化发现^［10］在正常前列腺基底细胞中有TNF受体相关基因TRAF-4的表达，而腺上皮细胞没有TRAF-4的表达。Roklin等^［11］进一步通过实验证实，与其它前列腺癌细胞不同，DU-145细胞不但存在死亡受体(Fas)的跨膜及死亡结构域的表达，而且表达TNF家族成员CD40。本实验在维甲酸诱导DU-145细胞凋亡过程中，克隆出大量TNF家族基因，也从一方面证实了TNF在前列腺癌细胞凋亡过程中起着很重要的作用。我们知道，bcl-2作为抗凋亡基因之一，与肿瘤细胞的凋亡关系密切，国际乳腺癌研究小组Natha^［12］等人通过对107名乳腺癌患者的研究发现，患者的肿瘤细胞中，c-erb b-2基因与bcl-2基因的表达呈负相关(P=0.002)，这高度提示c-erb B-2基因可能存在促进肿瘤细胞凋亡的作用。1999年He q^［13］等人也发现c-erb B-2基因表达的高低和凋亡指数(AI)的大小与结肠直肠癌患者的血管淋巴转移能力有关，而本实验也首次发现在前列腺癌细胞凋亡过程中，c-erb b-2基因可能起一定作用，这也从另一方面证实C-erb B-2基因与凋亡关系密切。

　　3.3　关于克隆基因方法的改进　我们知道，传统的DD-PCR技术工作量很大，得到的片段较小，而且片段在编码区内的几率小，同时假阳性率高，最高可达80%，因而工作效率低，而消减杂交技术同样步骤烦琐，工作量大，假阳性率高，而且对于低丰度的基因不能进行有效克隆^［14］。本实验所采用的基于PCR的消减杂交方法是建立在Cap-finder技术，LD-PCR biotion-dNTP，磁性分离系统及Sephacryl离心柱分离技术等多种新技术手段之上，在很大程度上解决了上述问题，它简化了实验步骤，减少了假阳性率的发生，对低丰度基因的克隆效果有很大提高，而且得到的序列多在编码区内。这种新方法为克隆新基因提供了一个有意义的尝试。

　　邵晨（第四军医大学西京医院泌尿外科，西安　710032)

　　邵国兴（第四军医大学西京医院泌尿外科，西安　710032)

　　王禾（第四军医大学西京医院泌尿外科，西安　710032)

　　陈宝琦（第四军医大学西京医院泌尿外科，西安　710032)

　　贺大林（西安交通大学第一医院泌尿外科)

　　秦荣良（第四军医大学西京医院泌尿外科，西安　710032)

　　朱峰（西安交通大学第一医院泌尿外科)

　　赵忠良（第四军医大学生物化学及分子生物学教研室）

　　参考文献：

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