转移前列腺癌细胞RT-PCR检测方法的建立(摘要)

中华泌尿外科杂志 1998年第11期第19卷 论著摘要

作者：李保昌　杨道理

单位：250031， 济南，济南军区总医院免疫科

　　材料与方法　前列腺癌组织块、阳性前列腺癌转移淋巴结各5例，阴性淋巴结4例，均取自手术标本，标本均经病理学检查证实；正常健康人3ml外周静脉血5份。将组织称重，匀浆，异硫氰酸胍/酚/氯仿/异戊醇法提取总RNA，外周血分离出有核细胞后同法提取RNA；针对PSM cDNA序列设计合成三条引物，引物序列为P₁：5′-GAATGCCAGAGGGCGATCTA；P₂:5′-AGGGGCCAAAGGAGTCATTCTCTACTCCGA;P₃:5′-TTCTAGGAGCTTCTGTGCATCATAGTATCC。在

　　AMV逆转录酶的催化下，下游外引物P₃引导合成PSM cDNA第一链，然后对逆转录产物进行巢式PCR扩增，第一次扩增取5μl逆转录产物为模板，应用P₁～P₃引物对扩增，PE-2400扩增条件为：94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒，30次循环。第二次巢式扩增以第一次扩增产物2μl为模板，P₂～P₃引物对退火温度为63℃，产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外光激发下检测扩增结果，产物片段长度应为262bp。将PCR产物片段进行核苷酸序列测定，测得序列与PSM cDNA序列对比以证实方法的特异性。经过实验条件的优化，在建立了稳定的实验方法的基础上，将前列腺癌组织中提取总RNA系列稀释后加入到正常人外周血有核细胞提取RNA中，评价方法的灵敏度，并通过PCR产物核酸序列测定鉴定方法的特异性。

　　结　果　应用RT-PCR方法可从5例前列腺癌组织标本和阳性癌转移淋巴结中稳定地扩增出262bp的产物带，而从正常健康人外周血标本和正常淋巴结均不能扩出262bp产物带。核酸序列分析表明产物序列与PSM cDNA序列一致，方法具有极好的特异性。系列稀释实验表明方法敏感度极高，可测出每3ml全血中1个前列腺癌细胞的存在，能够满足测定微量转移前列腺癌细胞的需要。

　　讨　论　本研究应用巢式逆转录PCR技术检测转移前列腺癌细胞，可以准确测出患者体内异位侵袭、转移扩散的前列腺癌细胞。若能应用于临床前列腺癌患者的检测，在前列腺癌的诊断、转移的预测及治疗效果评价方面有较好的应用价值。

　　应用高灵敏度和特异的巢式逆转录技术(RT-PCR)检测前列腺特异膜抗原(PSM)mRNA的方法，用于检测前列腺癌患者体内异位存在的转移前列腺癌细胞，以期有助于对前列腺癌的诊断、病理分期、疗效监测和病情预后。报告如下。

(收稿：1997-12-17　修回：1998-07-20)