宫颈癌p53蛋白表达和细胞增殖活性

　　第四军医大学学报1999年第20卷第2期

宋举武　潘晓琳　李洪安　朱永雄　李锋　宋静

　　摘　要　目的：研究p53蛋白，PCNA，DNA含量在宫颈癌及癌前病变组织中的表达及其意义.方法：用免疫组化ABC法和图像分析法，检测p53蛋白、PCNA和DNA含量，对56例正常宫颈粘膜、宫颈上皮内瘤变、宫颈浸润性鳞癌进行研究.结果：p53表达阳性率、PCNA细胞增殖指数和DNA含量随癌组织分级依次增高，p53蛋白在正常粘膜不表达，在宫颈上皮瘤变和原位癌少量表达，在宫颈浸润癌表达明显增高.结论：p53含量和细胞活性增高与宫颈粘膜癌变发生及恶性程度有关. pCNA增殖指数、DNA含量和多倍体细胞的出现，对宫颈癌的早期诊断有一定意义. p53蛋白的阳性表达在宫颈癌发生中不是一个晚期事件.

　　关键词：宫颈肿瘤　蛋白质p53　PCNA　DNA

　　0　引言

　　研究表明，p53基因结构及表达异常与多种恶性肿瘤的发生、发展及预后有关.增殖细胞核抗原(PCNA)和DNA含量能反映细胞增殖活性. 我们对56例宫颈癌和癌前病变以及正常宫颈组织进行了p53蛋白和PCNA的检测和DNA含量的测定，以探讨p53在宫颈癌和癌前病变中的表达及其与细胞增殖活性的关系和意义.

　　1　材料和方法

　　1.1　标本来源　56例宫颈癌和癌前病变组织及正常对照组织取自石河子大学医学院一附院病理科1979～1995年活检及手术标本蜡块，其中宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelial neoplasia, CIN)5例，原位癌10例，浸润性鳞癌Ⅰ级5例，Ⅱ级24例，Ⅲ级7例，正常宫颈粘膜5例.每例标本制成5 μm切片3张，分别进行p53，PCNA免疫组化染色和DNA feulgen染色.

　　1.2　免疫组化测定　①试剂：p53单克隆抗体(DO-7)和PCNA单克隆抗体(PC10)均为DAKO公司产品，生物素化二抗和ABC试剂盒为美国Vector公司产品. p53和PCNA稀释度为1∶50. ②方法：采用微波抗原修复技术和过氧化物酶标ABC法.③结果判定：p53和PCNA阳性反应是指棕黄色产物定位于肿瘤细胞核，PCNA以增殖指数表示，即对每一例切片随机观察10个高倍视野，每个视野计100个细胞中PCNA阳性细胞数，取其平均值.

　　1.3　图像分析　采用CMIAS-008 B型彩色图像分析系统对56例Feulgen染色切片上的病变细胞核进行了DNA含量的测定，以其积分光密度的值进行计算.同时测每张切片的小淋巴细胞50个，取其DNA含量(积分光密度)平均值作为正常2倍体(2C)细胞DNA标准值，换算肿瘤细胞的DNA含量和染色体倍体数.

　　1.4　统计学方法　PCNA增殖指数及DNA积分光密度均数采用方差分析，p53阳性百分率采用LOGISTIC回归分析，各组数据进行相关分析.

　　2　结果

　　2.1　p53阳性表达　46例宫颈鳞癌中p53表达的阳性率为41.3%(19/46)，在5例CIN中为20.0%(2/5)，5例正常宫颈粘膜上皮均为阴性. p53阳性率随组织学分级依次增高，经LOGISTIC回归分析，在鳞癌Ⅱ级和Ⅲ级之间具有显著性差异(P＜0.05).

　　2.2　PCNA阳性细胞分布与增殖指数　在正常宫颈鳞状上皮，仅于基底层上方见少量呈单层带状的PCNA阳性细胞.在CIN，PCNA阳性细胞带渐上移，阳性细胞也增多.在宫颈鳞癌，PCNA阳性细胞带显著增厚上移.阳性细胞较密集，分布也无规律. PCNA增殖指数的均数从CIN至鳞癌Ⅲ级而依次升高，方差分析显示各组间差异具有显著性(P＜0.01),组间两两比较显示在CIN和原位癌，浸润性鳞癌Ⅱ级和Ⅲ级之间具有显著性差异(P＜0.05).

　　2.3　DNA含量及倍体分布　DNA含量的均数亦随组织学分级而依次增高，方差分析显示组间差异具有显著性(P=0.0107)，两两比较显示在CIN和原位癌、浸润性鳞癌Ⅰ级和Ⅱ级，Ⅱ级和Ⅲ级之间具有显著性差异(P＜0.05). dNA倍体分布为，正常宫颈粘膜和CIN，没有5C以上细胞出现，原位癌及浸润性鳞癌出现5 c以上细胞，并随组织学分级依次增高，两两比较显示在CIN和原位癌，Ⅰ级和Ⅱ级，Ⅱ级和Ⅲ级之间均具有显著性差异(P＜0.05).

　　相关分析显示，p53阳性率和PCNA增殖指数及DNA含量呈正相关(r=0.9699, p＜0.01; r=0.8925, P＜0.025，Tab 1).

表1　p53阳性表达PCNA增殖指数DNA含量与组织学分级的关系

　　tab 1　Relationships between the histology grade and the positive expression of p53, the proliferating index of PCNA and DNA contents

　　^aP＜0.05 vs squamous cell carinoma Ⅲ；^cP＜0.05，^gP＜0.05 vs squamous cell carcinoma I；^eP＜0.05 vs carcinoma in situ.3　讨论

　　野生型p53是重要的细胞生长负调节因子，一般认为，其免疫组化阳性表达即表示有p53基因的突变. pCNA增殖指数、细胞DNA含量及倍体水平能反映细胞的增殖活性.我们的研究结果显示p53阳性率、PCNA增殖指数、DNA含量及倍体水平在正常宫颈粘膜、CIN及宫颈癌各组织学分级中逐渐增高，表明p53蛋白异常及细胞增殖活性的增高和宫颈粘膜癌变的发生及恶性程度有关；p53阳性率与PCNA增殖指数及DNA含量呈正相关，也反映了p53基因的表达异常使其丧失了对细胞生长的负调节作用，从而使细胞发生异常增殖.

　　细胞的DNA含量及倍体水平能反映细胞的增殖活性. Nasiell^［1］和Naslund^［2］报道在宫颈粘膜病变中核DNA含量测定和非整倍体出现对于癌前病变的诊断具有意义.刘坤平等^［3］的研究结果揭示多倍体细胞的出现可能是细胞增殖极为活跃的重要指标.本组资料各组织学分级间DNA含量随组织学分级增加依次增高，在CIN和原位癌、浸润性鳞癌Ⅰ级和Ⅱ级、Ⅱ级和Ⅲ级之间具有显著性差异(P＜0.05).3C～4C以上细胞比例依次增大，其中5C以上细胞比例改变显著，在正常宫颈粘膜和CIN没有5C以上细胞出现，原位癌为3%，浸润性鳞癌Ⅰ级为4%，而Ⅱ级和Ⅲ级分别为19.5%和21.9%，反映了细胞增殖活性的增高与宫颈粘膜癌变的发生、发展及恶性程度有关，提示DNA含量增高和5C以上细胞的出现对早期宫颈癌的形态学诊断及生物学行为的判断具有一定的意义.

　　本研究中PCNA的增殖指数随组织学分级而逐渐增高，阳性细胞分布特点也发生变化，说明宫颈粘膜上皮从异常增生到恶性转化的过程中细胞增殖失控，出现了过度增殖，与多数研究者的研究结果相符，提示^［4］p53异常表达及蛋白积累在宫颈癌的癌变发生过程中可能是一个晚期事件^［5～7］.但在5例CIN中有1例p53阳性表达，这一现象支持Mittal等^［8］的研究结果. mittal等的研究认为p53阳性表达频繁地出现于宫颈粘膜癌前病变，甚至良性病变，提示有早期诊断意义，p53的阳性表达可能不是一个晚期事件.但因本研究例数少，有待于进一步探讨.

　　作者简介：宋举武，男，1941-11-21生，四川键为人，教授.1967年第三军医大学医疗系毕业，三次进修于第四军医大学病理教研室.获军队科技进步三等奖、四等奖各两项，国家发明专利一项，被评为全军优秀教师.电话：(0994)4505386

　　作者单位：宋举武　朱永雄　宋　静　兰州医高专呼图壁分校病理教研室　新疆　呼图壁　831200潘晓琳　李洪安　李　锋　石河子大学医学院病理教研室

　　参考文献

　　1.Nasiell K.Retrospective DNA analysis in cervical dysplasia as related to neoplastic progession or regression.Analyt Quant Cytol histol,1979；1：103-106

　　2.Naslund I.Nuclear DNA changes during pathogenesis of squamous carcinoma of the cervix in 3,4-benzopyrene-tyeated mic.Analyt Quant Cytol Histol,1987; 9:411-418

　　3.刘坤平，郑　杰，胡文浩 et al.宫颈粘膜癌变过程中DNA含量、AgNOR及核形态变化的定量分析.中华物理医学杂志，1994；16：150-153

　　4.Porter PL.Widespread p53 overexpression in human malignanttumors.Am J pathol,1992;140:143-153

　　5.Ter Harmsel B,van Belkum A,Quint W et al.p53 and human papillomavirus type 16 in cervical intraepithelial neoplasia and carcinoma.Int J Gynecol pathol,1995;14:125-133

　　6.Steinbeck RG,Heselmeyer KM,Moberger HB et al.The relationship between proliferation cell nuclear antigen (PCNA),nuclear DNA content and mutant p53 during gengsis of cervical carcinoma.Acta Oncol,1995；34：171-176

　　7.Holm R,Skomedal H,Hell A et al.Immunohirtocheimical analsis of p53 protein overexpression in normal,premalignant and malignant tissues of the cervix uteri.J Pathol,1993；169：21-26

　　8.Mittal KR,Lin O,Chan W et al.Cervical squamous dysplasias and carcinomas with immunodetectable p53 frequently contain HPV.Gynecol Oncol,1995；58：289-294