聚合酶链反应检测肺结核患者外周血单个核细胞中结核分支杆菌DNA

中华结核和呼吸感染 1998年第3期第21卷 论　　著

作者：唐少华　鲍小欧　郑廷迪

单位：325000 温州市第二人民医院遗传室(唐少华、郑廷迪)，内科(鲍小欧)

　　关键词： 结核，肺；聚合酶链反应；分支杆菌，结核

　　【摘要】　目的　探讨外周血单个核细胞中结核分支杆菌DNA检测在肺结核诊断中的价值。方法　采用改良Triton X-100法分离、制备单个核细胞中模板DNA，聚合酶链反应(PCR)扩增结核分支杆菌240 bp基因片段，同时分析了影响PCR结果的有关因素。结果　89例肺结核患者的血标本、84例肺结核患者的痰标本中，结核分支杆菌DNA阳性率分别为73%和57%；84例肺结核患者外周血、痰标本配对检测总阳性率可达87%。30例非结核患者的血标本PCR阳性率为10%。结论　改良Triton X-100法处理标本后用PCR检测外周血单个核细胞中结核分支杆菌DNA具有快速、简便、灵敏、特异等优点，结合痰标本检测，可提高肺结核诊断的敏感性和准确性，对肺结核的诊断具有重要的参考价值。

Detection of Mycobacterium tuberculosis DNA in peripheral blood mononuclear cells from patients with pulmonary tuberculosis by polymerase chain reaction technique

Tang Shaohua^*, Bao Xiaoou, Zheng Tingdi. ^*　Department of Heredity, Second Hospital of Wenzhen, Wenzhen 325000

　　【Abstract】　Objective　To evaluate the clinical value of detection of Mycobacterium tuberculosis DNA (MTB-DNA) in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) for diagnosis of pulmonary tuberculosis.Method　Polymerase chain reaction (PCR) technique was used to amplify gene of 240 bp DNA fragment prepared by Triton X-100 method, and some factors affecting PCR result were also analysed.Result　In blood samples of 89 patients with pulmonary tuberculosis and in sputum samples of 84 patients with pulmonary tuberculosis, the positive rates of PCR were 73% and 57% respectively, and the total positive rate of combinative detection of blood and sputum samples was 87% in 84 pulmonary tuberculosis patients. In 30 non-tuberculosis patients, 3 showed MTB-DNA positive. Conclusion　PCR technique prepared by Triton X-100 method is rapid, simple, specific, and sensitive for detection of MTB-DNA in PBMC, and its sensitivity and accuracy could be increased in combination with sputum MTB examination. Detection of MTB-DNA in PMBC is of value in diagnosis of pulmonary tuberculosis.

　　【Key words】　Tuberculosis, pulmonary　　Polymerase chain reaction　　Mycobacterium tuberculosis

　　结核分支杆菌的细菌学检查是结核病病原学诊断的直接证据。从外周血细胞免疫激活证据表明，结核分支杆菌通常可进入血液其致敏的细胞中。为探讨外周血单个核细胞中结核分支杆菌DNA检测在肺结核诊断中的意义，我们采用聚合酶链反应(PCR)技术检测了89例肺结核患者的外周血和(或)痰标本，30例非结核患者的血标本。现将结果报告如下：

对象与方法

　　1.对象：(1)89例肺结核患者均为我院住院及门诊病例，根据临床表现、体征、胸部X线、CT及细菌学检查等确诊。(2)30例非结核病例选自我院门诊及住院患者，其中10例为健康体检人员、10例为肺癌患者、10例为临床诊断为慢性支气管炎、肝硬化、肾炎、胃癌等患者。

　　2.标本采集：所有患者均采集3 ml血，EDTA-Na₂抗凝，4℃保存。84例肺结核患者同时留取晨痰送检。

　　3.主要试剂：结核分支杆菌PCR诊断试剂盒由伊利康生物技术有限公司提供，扩增产物片段长度为240 bp，引物序列为：1：5′-TCCGCTGCCAGTCGTCTTCC-3′；2：5′-GTCCTCGCGAGTCTAGGCCA-3′。

　　4.实验方法：(1)单个核细胞分离与DNA提取：取1 ml全血，加2 ml试剂(0.32 mol/L蔗糖，5 mmol/L MgCl₂，1% Triton X-100，0.01 mol/L Tris-HCl，pH7.6)，振摇至溶液均匀透明，离心10分钟(10 000 r/min)，重复2次，至上清无血色为止。去上清后，加缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，50 mmol/L NaCl， 10 mmol/L MgCl₂)20 μl，加重蒸水180 μl，加蛋白酶K(6 g/L)10 μl，置50℃2小时，后在沸水中煮10分钟，离心5分钟(3 000 r/min)，取上清备用。(2)PCR扩增：按说明书进行。扩增产物在2%琼脂糖(含溴化乙锭)上电泳，紫外灯下观察。

结果

　　肺结核患者89份外周血标本和84份痰标本中，结核分支杆菌DNA阳性率分别为73%(65/89)和57%(48/84)。外周血中结核分支杆菌阳性率明显高于痰标本。30例非结核患者血标本中，结核分支杆菌DNA阳性3例，阳性率为10%。其中1例为支气管炎患者，另2例为肺癌患者，均无结核病史，并经2次抽血重复检测结果仍为阳性。肺癌患者其痰标本PCR为阳性。

　　84例肺结核患者外周血和痰标本中结核分支杆菌DNA的配对检测发现，外周血中检出率(71%)较痰标本(54%)高(P＜0.05)，而13例外周血阴性患者的痰中结核分支杆菌DNA阳性，28例外周血阳性患者的痰为阴性，两种标本均阳性者32例(附表)。肺结核患者血、痰标本同时检测符合率为51%，总阳性率可达87%。

附表　84例肺结核患者外周血和痰中结核分支杆菌DNA的配对检测结果

　　注：血、痰标本阳性率比较，χ²=5.714，P＜0.05

讨论

　　PCR技术已被广泛地用于肺结核的诊断中，其中检测临床痰标本结核分支杆菌DNA的报道较多，阳性率大约为53%～80%^［1，2］。我们应用PCR技术检测84例肺结核患者痰标本，阳性率为57%，与文献报道相符。

　　外周血结核分支杆菌DNA的检测报道有血清、单个核细胞内结核分支杆菌DNA检测两种。李国利等^［3］报道66例肺结核患者血清结核分支杆菌DNA阳性率为39%；张吉旺等^［4］报道95例肺结核患者单个核细胞内结核分支杆菌DNA阳性率为85%；Schluger等^［5］报道8例肺结核患者单个核细胞层和血清结核分支杆菌DNA，结果单个核细胞层均阳性而血清均阴性。以上结果提示肺结核患者结核灶内的结核分支杆菌可通过肺泡排放到血液，被单个核细胞吞噬；或病灶内吞噬了结核分支杆菌的单核-巨噬细胞进入血液，用敏感的PCR法检测单个核细胞内结核分支杆菌DNA较血清中阳性率高。我们采用改良Triton X-100 法提取单个核细胞内结核分支杆菌DNA后再行PCR扩增，省去了经典的苯酚抽提、DNA干燥等过程，使方法更简便、实用。运用此法检测了89例肺结核患者，结果阳性率为73%，表明PCR检测外周血单个核细胞内结核分支杆菌DNA为肺结核诊断的有效方法。

　　84例肺结核患者两种标本配对检测发现，外周血和痰标本的检测结果符合率为51%，总阳性率为87%，表明两种标本同时检测具有互补作用，可提高检测的敏感性和准确性。此外，外周血单个核细胞内结核分支杆菌DNA的检测对于一些无痰肺结核患者无疑是一项很有价值的检查手段。

　　然而，近年来的临床实践证明，PCR技术也有一定的局限性，主要表现在假阳性方面。本试验中假阳性率为10%。3例假阳性患者均经重复检测，2例肺癌患者痰PCR结果也阳性。假阳性的原因主要有：(1)污染：PCR的敏感性极高，微量的污染即可导致假阳性。所以在标本收集至整个操作过程必须“无菌操作”，避免污染。(2)引物的特异性：此是造成假阳性的重要原因。据陈刚等^［2］报道，3种不同引物序列和扩增产物片段长度的PCR试剂的PCR结果存在非常显著性差异，引物序列和扩增产物片段长度是影响PCR检测结核分支杆菌敏感性和特异性的主要因素。如果所选用的引物与其他细胞之间有交叉序列，则PCR也可以扩增该细胞的DNA而致假阳性。本试验中2例肺癌患者的痰、血标本PCR均阳性，可能属于此类原因所致，所以筛选理想的引物合成高质量的试剂盒是避免假阳性的关键。(3)结核分支杆菌感染的“亚临床状态”^［6］：潜在感染的结核分支杆菌被扩增呈阳性。本试验中的另一种假阳性可能属于此类。对这种“带菌者”血中单个核细胞内结核分支杆菌的“含量”检测是今后的新课题。此类可疑患者需结合临床表现、其他实验室检查、影像学检查等综合分析。

　　综上所述，采用高质量的试剂、规范化操作检测外周血单个核细胞中结核分支杆菌DNA，对肺结核的诊断具有重要的参考价值。

　　参考文献

　　1　庄玉辉，李国利，张小刚,等.脱氧核糖核酸聚合酶链反应快速检测结核临床标本中结核菌的评价.中华结核和呼吸杂志，1993，16：26-29.

　　2　陈刚，陈兆军.聚合酶链反应试剂对检测痰结核分支杆菌的影响.中华结核和呼吸杂志，1996,19：294-296.

　　3　李国利，庄玉辉，张小刚,等.聚合酶链反应检测肺结核患者外周血中结核杆菌的临床应用价值.中华结核和呼吸杂志，1995，18：343.

　　4　张吉旺，彭晓，朱俊芳.肺结核患者外周血白细胞中结核分支杆菌DNA的检测.中华医学检验杂志，1996，19：173-175.

　　5　Schluger NW, Kinney D, Harkin TJ, et al. Clinical utility of the polymerase chain reaction in the diagnosis of infections due to Mycobacterium tuberculosis. Chest, 1994,105：1116.

　　6　彭卫生，王英年，肖志成主编.新编结核病学.北京：中国医药科技出版社，1994.47-234.

(收稿：1997-08-22　　修回：1997-12-04)