AmpliSensor-聚合酶链反应定量检测肺结核患者外周血结核分支杆菌DN
中华结核和呼吸感染 1999年第8期第22卷 论著摘要
作者：谭耀驹 李一耕 张言斌 谢贝 萧婉云 陈虹
单位：510095 广州市胸科医院肺部疾病研究所
关键词： 聚合酶链反应；结核，肺；分支杆菌，结核
【摘要】 目的 探讨AmpliSensor-聚合酶链反应(AmpliSensor-PCR)定量检测外周血中结核分支杆菌DNA(TB-DNA)在肺结核的应用价值。方法 采用QIAamp和AcuPure法提取，制备全血中模板TB-DNA，应用AmpliSensor-PCR定量检测，并与IS6110-单管巢式聚合酶链反应（SN-PCR）作比较。结果200例肺结核患者的血液标本中，两种方法测得结核分支杆菌DNA的阳性率分别为60.5%、63.5%。85例非结核肺病患者（包括22名献血员）的阳性率分别为4.7%、8.2%。结论 AmpliSensor-PCR检测全血中的TB-DNA是一种敏感性、特异性较高的方法，其含量的变化对疾病的预后有一定的提示作用。
Quantitative detection of mycobacterium tuberculosis DNA in peripheral blood from patients with pulmonary tuberculosis by AmpliSensor-PCR technique
TAN Yaoju, LI Yigeng, ZHANG yanbin
Pulmonary Disease Institute, guangzhou Chest Hospital, Guangzhou 510095
【Abstract】 Objective To evaluate the clinical value of the quantitative detection of Mycobacterium tuberculosis DNA by Amplisensor-PCR in peripheral blood from patients with pulmonary tuberculosis. Methods The model of Mycobacterium tuberculosis DNA in blood was made by QIAamp and AcuPure methods, quantitative detection of mycobacterium tuberculosis DNA by AmpliSensor-PCR technique and the results were compared with IS6110 single-tube nested PCR (SN-PCR). Results The peripheral blood from 200 patients with pulmonary tuberculosis were detected respectively by using AmpliSensor-PCR and IS6110 SN-PCR methods. The positive rates of mycobacterium tuberculosis DNA were 60.5% and 63.5% respectively, and that from85 patients with non-pulmonary tubeculosis were 4.7%, 8.2%. Conclusions AmpliSensor-PCR method showed higher sensitivity and specificity in detecting the Mycobacterium tubeculosis DNA from peripheral blood. The variation of the TB-DNA may be useful in evaluating the prognosis of the patients.
【Key words】 Polymerase chain reaction Tuberculosis, pulmonary Mycobacterium tuberculosis
应用聚合酶链反应（PCR）检测外周血中单个核细胞的结核分支杆菌DNA（TB-DNA）的报告已很普遍［1-3］，定性PCR仅能提示结核分支杆菌的感染，不能反映其程度，也不能判断治疗效果和预测预后。在肺结核患者，血液中的TB-DNA主要是患者结核灶内的结核分支杆菌可通过肺泡排放到血液中，被单个核细胞吞噬；或病灶内吞噬了结核分支杆菌的单核-巨噬细胞进入血液。为探讨血液中TB-DNA检测在肺结核诊断及判断疾病发展的意义，我们应用AmpliSensor-PCR［4］定量检测全血中TB-DNA的量，并与IS6110-单管巢式聚合酶链反应（SN-PCR）系统进行比较，现将结果报告如下。
材料与方法
一、材料
1.检测对象：肺结核200例（其中Ⅱ型肺结核23例，Ⅲ型肺结核92例，Ⅳ型肺结核85例），经X线和痰涂片、培养找到结核分支杆菌及（或）临床诊断性治疗确诊，其中菌阳68例。肺癌42例，经病理检查确诊。肺炎及慢性支气管炎等肺部疾病21例。以上患者均为我院的住院病例。另献血员22名，由广州市中心血站提供。
2.主要仪器及试剂：PE-9600 DNA扩增仪购自美国PE公司；AG-9600-Minilyzer荧光DNA分析仪及98ASAP软件、AmpliSensor-PCR不对称反应系统、信号扩增反应系统、TB-DNA标准品等购自美国Biotronics公司；IS6110-SN-PCR系统及地高辛标记的DNA探针杂交系统由香港大学微生物系任永昌博士惠赠。
表1 AmpliSensor-PCR和IS6110-SN-PCR反应体系及反应条件
| |
AmpliSensor-PCR |
|
IS6110-SN-PCR |
| 反应体系 |
(1)不对称扩增反应混合液（10 μl）
限量引物:5′-TAGGCGTCGGTGACA
AAGGC-3′(0.12 μmol/L)
过量引物:5′-TACGACCACATCAA
CCG-3′(0.15 μmol/L)
Tricine 50 mmol/L, pH 8.9, KCl 40 nmol/L,
dNTP 1 mmol/L, MgCl2 4 mmol/L
(2)信号扩增反应混合液（5 μl）
信号引物: 0.14 μmol/L
过量引物: 0.7 μmol/L
Tricine 50 mmol/L, pH 8.9, KCl 40 mmol/L
dNTP 1 mmol/L, MgCl2 4 mmol/L
(3)阳性标准品（5 μl)
TB-DNA片段1×106 CPS／ml
作1∶10稀释，最低敏感度为1×10拷贝／ml |
PCR反应混合液（90μl）
外引物:TB36.7: 5′-CCGGCCAGCACGCTAATT
AACGGTTC-3′(0.2 μmol/L)
TB746: 5′-TGTGGCCGG
内引物:TB455:5′-CTGCACACAGCTGACCGA-
3′(0.75 μmol/L)
TB670:5′-CGTTCGACGGTGCATCTG-
3′(0.75 μmol/L)
MgCl2: 2.0mmol/L
dNTP: 0.15mmol/L
pH 8.9 |
| 聚合酶 |
1.5U/孔 |
2.0 U/孔 |
| 反应体积 |
20μl |
100μl |
| 反应条件 |
90℃预热3分钟，95℃40秒，60℃40秒，72℃50秒。在24个循环加入信号反应液进行基础阅读，然后分别于每2个循环读取一次荧光系数，达到10拷贝／ml时停止 |
94℃预热12分钟，94℃45秒，55℃1分钟45秒，15个循环后进入94℃45秒，5℃45秒，72℃60秒，45个循环 |
| 结果观察 |
通过98ASAP软件分析，获得结果，按软件要求计算，取250拷贝／ml为临界值 |
取PCR扩增产物电泳，80 V×1小时，EB染色，紫外检测仪下观察，见216 bp、380 bp或单一的216bp清晰的扩增带为阳性，最后用地高辛标记的DNA探针作鉴定，符合为阳性 |
二、方法
1.取用乙二胺四乙酸二钾（EDTA）抗凝的全血200 μl，加蛋白酶K和AL缓冲液，旋涡振荡15秒，70℃10分钟，再加200 μl无水乙醇，混匀后注入DNA吸附柱，800 r/min离心60秒，再使用AW缓冲液洗涤2次，AE液洗脱模板DNA。200μl洗脱液中加STG提取液250 μl，80℃水浴10分钟，然后加异丙醇400μl，充分混匀，13 000 r/min离心10分钟，去上清，见管底有一蓝点，KW液洗涤1次，13000 r/min离心3分钟，吸去上清，室温干燥10分钟，加50 μl ddH2O重悬，待DNA完全溶解后即可用于PCR检测。
2.AmpliSensor-PCR及IS6110-SN-PCR反应体系及反应条件，见表1。
结果
在200例肺结核患者外周血TB-DNA检测中，AmpliSensor-PCR法的阳性率60.5%（121／200），IS6110-SN-PCR法的阳性率63.5%（127／200），两种方法比较经χ2检验，差异无显著性（P＞0.05），符合率达92%。结果详见表2。
全血中AmpliSensor-PCR定量法测定TB-DNA的范围为101～105拷贝／ml。不同类型肺结核测定的结果见表3。
表2 TB-DNA的测定结果
| 组别 |
例数 |
AmpliSensor-PCR |
IS6110-SN-PCR |
| 阳性
例数 |
阳性率(%) |
阳性
例数 |
阳性率(%) |
| 肺结核 |
200 |
121 |
60.5 |
127 |
63.5 |
| 肺癌 |
42 |
2 |
4.8 |
4 |
9.5 |
| 其他肺部疾病 |
21 |
2 |
9.5 |
3 |
14.3 |
| 健康人群 |
22 |
0 |
0 |
0 |
0 |
表3 不同类型肺结核测定结果
| 型别 |
例数 |
AmpliSensor-PCR |
IS6110-SN-PCR |
| 阳性
例数 |
阳性率(%) |
阳性
例数 |
阳性率(%) |
| Ⅱ型肺结核 |
23 |
21 |
91.3* |
21 |
91.3* |
| Ⅲ型肺结核 |
92 |
48 |
52.2 |
46 |
50.0 |
| Ⅳ型肺结核 |
85 |
52 |
61.2 |
60 |
70.6 |
注：*与Ⅲ、Ⅳ型肺结核比较，经χ2检验P＜0.05讨论
PCR技术检测外周血中结核分支杆菌DNA，国内外已有较多的报道［1-3,5,6］，阳性率在9%～100%。我们对全血用蛋白酶K消化，DNA吸附柱吸附，然后用AE缓冲液洗脱，再经STG缓冲液浓缩，提取DNA进行检测，两种方法的阳性率分别为60.5%、63.5%，较张吉旺等［1］、唐少华等［2］报道的低，这主要与标本用量有一定的关系；但较李国利等［3］报道的要高，这可能与所选择的提取方法及取样不同有关。
本试验中假阳性率分别为4.7%（4／85）、8.2%（7／85），较唐少华等报告的10%为低，因本试验中健康人群的检测均为阴性。造成假阳性的原因可能为这部分肺部疾病患者为双重感染或样本留取过程中被污染。
从本研究的资料看，有些痰涂片、培养和痰PCR均阴性的肺结核患者，全血中的PCR阳性，全血中PCR阳性率与疾病的程度、分型等有一定的相关性。从本研究的结果看，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型肺结核的阳性率分别为91.3%、52.2%、61.2%。前者与后两者比较，P＜0.05。所以，PCR检测血液中结核分支杆菌的阳性率在不同类型的肺结核患者中是不同的，以Ⅱ型肺结核患者的阳性率最高。这说明血液中的TB-DNA的含量可能与机体的免疫力有一定的关系。
我们追踪观察了9例肺结核患者，其中6例X线片及临床表现均有明显的改善，血液中DNA的量呈递减趋势，其中1例1个月后复查转阴，4例在3个月复查时转阴，另1例在6个月转阴。而最后1例有空洞形成，并伴有咯血，另3例为难治性肺结核，半年后，其血液中TB-DNA还处在一个较高的水平（＞103拷贝／ml），所以，观察血液中TB-DNA的含量的变化，可能更能反映疗效。
本研究中采用大家公认的敏感性、特异性均较好的IS6110-SN-PCR，最后以地高辛标记的DNA探针作鉴定的方法作对照试验，两组方法的符合率在92%，说明AmpliSensor-PCR的检测结果是可信的，但由于DNA的提取及纯化比较繁复，操作要求严格，容易造成污染，且由于DNA提取过程中DNA的损失没法作平衡估计，所以，目前DNA的定量只能反映它的值的变化，不能确切知道靶DNA的量。
参考文献
1 张吉旺，彭晓，朱俊芳．肺结核患者外周血白细胞中结核分枝杆菌DNA的检测.中华医学检验杂志，1996,19:173-175.
2 唐少华，鲍小欧，郑廷迪．聚合酶链反应检测肺结核外周血单个核细胞中结核分支杆菌DNA.中华结核和呼吸杂志，1998,21:178-180.
3 李国利，庄玉辉，张小刚，等．聚合酶链反应检测肺结核患者外周血中结核杆菌的临床应用价值.中华结核和呼吸杂志，1995,18:343-345.
4 谭耀驹，李一耕，谭守勇．AmpliSensor-聚合酶链反应技术检测结核分支杆菌及临床应用.中华结核和呼吸杂志，1998, 21：79-81.
5 Schluger NW, Condos R, Lewis S, et al. Amplification of DNA of mycobacterium tuberculosis from peripheral blood of patients with pulmonary tuberculosis. Lancet, 1994, 344:232-233.
6 Kolk AH, Kox LF, Kuijper S, et al. Detection of Mycobacterium tuberculosis in peripheral blood. Lancet, 1994, 344:694-696.
收稿：1998-12-22修回：1999-02-12
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