程化疗满疗程残存空洞菌阴肺结核患者痰致病力的研究

中华结核和呼吸感染 2000年第9期第23卷 论著

作者：冯惠芝　杜佰凤　董志云　董丽华　吴瑞仙　杨鸿春　于维琴　苏焯

单位：冯惠芝　杜佰凤　董志云　董丽华　吴瑞仙　杨鸿春　于维琴（300222 天津市肺科医院）；苏焯（天津医科大学）

　　关键词： 结核，肺分支杆菌，结核；短程化疗；致病力

　　【摘要】　目的　探讨菌阴肺结核患者短程化疗满疗程后，残存空洞内痰的致病力。方法　选初治短程化疗已完成、痰菌阴转残存空洞患者的痰接种豚鼠，观察其体重等一般情况及局部淋巴结有否肿大，6周后解剖，观察内脏有无结核病变并做结核分支杆菌培养及药敏试验，均设有阴性和阳性对照。结果　实验组63例患者痰中有3例（5%）患者的痰能使豚鼠的肺、肝、脾出现不同数量的结核结节，结核分支杆菌培养也阳性。结论　短程化疗后残存空洞菌阴肺结核患者的痰5%仍有致病力。对痰菌阴转速度慢、耐药病例，化疗疗程应延长，并应监测痰菌情况。

Study on pathogenicity of sputum from cavity of sputum negative patients with pulmonary tuberculosis after short course chemotherapy

FENG Huizhi，DU Baifeng，DONG Zhiyun，et al.

　　（Tianjin Lung Hospital，Tianjin 300222，China）

　　【Abstract】　Objective　To find out whether or not the sputa of pulmonary tuberculosis（PTB） patients with cavitation but sputum negative have pathogenicity after short course chemotherapy.Methods Guinea pigs were inoculated with sputa of PTB patients who were with cavitation but sputum negative after having finished short course chemotherapy. Then their body weight，enlargement of local lymph nodes and other ordinary symptom were observed. Six weeks later，pathological changes of TB in the internal organs were examined by dissecting these guinea pigs. Culture and drug resistance test of tubercle bacillus were also conducted. All of which were with negative and positive controls.Results Of the 63 cases included，3(5%) patients′ sputa resulted in tuberculous nodulation varying in amount in lung，liver and spleen of these guinea pigs，and the culture for tubercle bacillus of these sputa was positive too.Conclusions 5% of sputum collected from PTB patients with cavitation but sputum negative still show pathogenicity after short course chemotherapy. For the cases with drug-resistant PTB and slow sputum negative conversion，the treatment should be prolonged and tubercle bacilli in their sputa should be monitored.

　　【Key words】　Tuberculosis，pulmonary；　　　Mycobacterium tuberculosis；　　　Short course chemotherapy；　Pathogenicity

　　结核病短程化疗后的复发问题依然存在^［1］，复发因素中残存空洞不能忽视，占复发因素的8.39%^［2］。为减少复发，使肺结核患者治疗个体化，我们对完成短程化疗、痰菌阴转而留有残存空洞患者的痰，从病理、细菌学角度进行了致病力的研究。

　　材料与方法

　　一、材料

　　1.实验痰标本：为初治短程化疗已完成（初治标准方案：2SHRZ/4HR）、痰菌阴转残存空洞肺结核患者晨起漱口后用力深咳的痰。痰菌阴转指每月2次涂片，1次培养，连续2个月阴性。涂片用Ziehl-Neelsen染色法。培养及药敏试验用改良罗氏(Lowenstein-Jensen)培养基。

　　2．实验动物：全部使用天津医科大学实验动物繁育场提供的豚鼠，体重250～350 g，实验前在腹部皮内接种1∶20 OT 0.1 ml，72 h观察结果，全部阴性。

　　3．结核分支杆菌L型菌培养基：由蚌埠铁路中心医院试验室提供。

　　4．阳性对照用菌株：为北京市结核病胸部肿瘤研究所提供的标准结核分支杆菌H₃₇R_V株。

　　二、方法

　　1．痰结核分支杆菌培养：在装有玻璃珠及痰液带盖塑料瓶内加与痰液等量的0.1%胰酶，充分消化后，再加入倍量的0.3%新洁尔灭振荡5 min。取处理的痰液0.1 ml接种于改良罗氏培基，4周后进行结果观察及记录。

　　2．痰结核分支杆菌L型菌培养：标本处理同上，取0.1 ml接种于结核分支杆菌L型菌培养基，放入37 ℃温箱进行培养观察。

　　3．痰豚鼠接种^［3，4］：（1）痰标本处理同前，无菌操作下，取1 ml处理后的标本，经皮肤消毒豚鼠右蹊部，腹腔内注射12只，后腿外侧肌肉内注射51只，每份标本接种豚鼠雌雄各1只。观察其体重等一般情况及局部淋巴结有无肿大、破溃现象，6周后全部剖检，对6周前死亡的豚鼠也同样观察。（2）动物解剖，观察豚鼠的肺、肝、脾、肾、肠系膜淋巴结有否结核病变，同时做脏器培养和病理检查。

　　4．动物内脏结核分支杆菌培养：无菌操作取出豚鼠肺、肝、脾，称重，采用组织定量培养法，即取病变部位的肺、肝组织各3 g、脾组织0.2 g，置组织研磨器中研磨，加入无菌盐水再研磨成匀浆，将此组织浆均稀释至10^-3/ml，取此上清液0.1 ml接种于改良罗氏培养基，共2支，37 ℃培养4周，记录菌落数目，阳性者做药敏实验。

　　5．动物内脏病理组织学检查：将内脏做成石蜡切片，在镜下进行组织学检查。

　　上述培养和动物接种均用同一份标本，并设有阳性和阴性对照。

　　结果

　　一、实验组患者痰结核分支杆菌培养

　　我们采集了63例短程化疗结束后患者的痰标本，结核分支杆菌培养均阴性。为了确保所用标本符合本课题选例标准（即痰菌阴转），豚鼠实验所用的同一份痰同时做结核分支杆菌培养，结果均阴性，说明临床提供病例符合本课题选例标准。

　　二、实验组患者痰L型结核分支杆菌培养

　　因L型结核分支杆菌不能在常规结核分支杆菌培养基生长，直接影响临床标本细菌学检出。为了排除课题标本有L型结核分支杆菌的可能，均同时做了L型结核分支杆菌培养，结果63例均阴性，说明本课题菌阴不受L型结核分支杆菌的影响。

　　三、豚鼠致病力实验

　　豚鼠接种后，多数有精神不振，食欲差，1周后大多恢复。编号6、53、57号标本的豚鼠表现消瘦、体重减轻，57号豚鼠有肛门出血。

　　解剖后的内脏观察：正常对照组：肺、肝、脾暗红色，表面光滑，无突起的结节。标准结核分支杆菌H₃₇Rv株组：肺、肝、脾均有充血、肿胀，表面布满微黄、灰白色突起的结核结节，脾及胃肿大，腹腔有少量渗液。实验组：有3只（即编号6、53、57）出现病变（表1），肾脏、腹腔未见病变。

表1　实验组豚鼠内脏结核结节分布及脾相对密度

　　注：结核结节以肉眼观察脏器表面有无结核结节为标准；-：无结节，+：1～4个结节，++：5～9个结节，表3同　　以上结果说明短程化疗完成后菌阴残存空洞的痰仍有一定的致病力。

　　四、豚鼠内脏结核分支杆菌培养

　　正常对照组：肺、肝、脾结核分支杆菌培养均阴性。标准结核分支杆菌H₃₇R_V株对照组：肺、肝、脾结核分支杆菌培养均阳性。实验组：编号6、53、57标本的豚鼠内脏结核分支杆菌培养，结果与肉眼观察一致（表2）。

表2　实验组豚鼠内脏结核分支杆菌培养结果

　　注：“-”为阴性，“+”为20个菌落以上。为排除牛分支杆菌及非结核分支杆菌，上述菌株均进行了噻吩-2-羧酸肼(TCH)(均阳性)和对硝基苯甲酸(PNB)(均阴性)培养基的鉴别培养　　表明肉眼观察结核结节组织的细菌学培养均阳性，短程化疗后菌阴残存空洞的痰能使豚鼠致病。

　　五、痰菌阴转时间

　　本组63例患者，痰菌1个月阴转2例，2个月阴转29例，3个月阴转15例，4个月阴转2例。3例痰致病患者其痰菌阴转时间及耐药情况见表3。

表3　3例致病患者痰菌阴转、耐药与痰菌致病情况

　　六、病理组织学观察

　　病变的豚鼠内脏均可见严重的充血、大量淋巴细胞浸润、少量组织细胞及郎罕巨噬细胞，符合结核病病理改变。余鼠内脏有不同程度的炎性改变，可能与注入标本的非特异性反应有关。讨论

　　从实验结果可见短程化疗后痰菌阴转肺结核残存空洞的痰并非全部失去传染性，仍有5%有致病作用。原因可能为：

　　一、与检出率有关

　　1997年北京结核病控制研究所赵莉等^［5］报道涂阳培阴5.7%，涂阴培阳13.3%，涂培均阳30.4%，总的菌阳率仅为49.4%。短程化疗完成后，菌阴残存空洞的痰，因化疗菌量大大减少，当低于检出极限（涂片每ml痰菌含量10³）则不易检出。因检出率低，短程化疗后菌阴残存空洞的痰约有5%的机会未被检出。

　　二、与化疗使结核分支杆菌活力降低^［5］有关

　　治疗后患者病变部分吸收好转，空洞内结核分支杆菌活力减低，可使培养不易成功。加之菌量大大减少，当痰菌含量低于每ml 10²时，培养可能出现阴性，而豚鼠对结核分支杆菌比较敏感，据报道只要有一个有活力的结核分支杆菌，就可使豚鼠致病，因此豚鼠实验比痰培养较为确切地反应痰菌情况。

　　三、与细菌的代谢状况有关

　　Canetti^［6］早就提出，休止状态的细菌（“resting” bacilli）不受化疗药物的影响。Mitchson等实验证明，结核病灶内可含有4类结核分支杆菌：A类，代谢活跃、持续生长繁殖；B类，大部分时间处于休眠状态，偶而有爆发性生长繁殖；C类，存在于巨噬细胞内，受酸性环境的抑制；D类，为休眠菌（dormant bacilli），完全处于休止状态。根据短程化疗的灭菌机制，前3类菌均可被所用药物杀灭，而对D类菌则毫无作为^［7、8］。Youmans^［9］认为结核分支杆菌的休眠状态，受机体获得性免疫力的抑制，一旦局部免疫力下降，细菌仍可恢复生长繁殖能力。因此短程化疗后痰菌阴转的患者，当机体免疫力下降时，休眠状态的结核分支杆菌可以复活。

　　四、与细菌耐药有关

　　3例都有不同程度的耐药（耐药情况见表3），3例均耐SM，1例耐INH，占耐药病例的27%（本课题菌阳耐药者11例），未检出结核分支杆菌15例及37例敏感者无一例致病，提示致病与耐药有关。3例均耐SM或许与耐SM的细菌致病力不减弱有关^［2］。

　　五、与痰菌阴转时间有关

　　3例痰致病患者痰阴转时间均在3个月以上（见表3），占3个月以上阴转者17例的18%，而2个月内痰菌阴转者31例及15例菌阴者均未发现致病，提示与痰菌阴转时间有关。

　　六、与L型结核分支杆菌的影响有关

　　因药物及某些因素的影响，结核分支杆菌细胞壁缺损^［10］形态发生变异，这类细菌称为L型结核分支杆菌^［11］，这类结核分支杆菌不能在常规结核分支杆菌培养基中生长，直接影响临床标本细菌学的检出，因此越来越引起临床学家的重视。为了排除这类细菌的影响，对痰菌阴转的病例应做L型结核分支杆菌的培养。

　　肺结核空洞患者短程化疗完成后痰菌阴转在理论上讲已达到组织灭菌，但仍然存在复发问题或体内结核分支杆菌复活问题，以上诸因素中耐药不应忽视。是否与机体的免疫有关，动物实验的结果与机体实际情况不可能完全一致^［12］。

　　目前短程化疗满疗程后，将菌阴做为停药指征。通过实验观察我们认为：短程化疗后菌阴残存空洞的痰5%仍有致病力。对痰菌阴转速度慢或耐药病例化疗疗程应延长并定期监测痰菌，这些少数病例需延长治疗的具体指标有待进一步探讨。

　　本研究受一些因素限制，未做跟踪实验观察。关于延长疗程问题，我们认为这些耐药病例6个月短程化疗时间欠佳。根据Crofton等有关专家拟定的《耐药结核病处理指南》^［13］及朱莉贞^［14］的看法，耐1～2种药（不耐R）者强化期3个月，巩固期6～9个月，一般可以治疗成功。本组有19例治疗9个月的患者，其痰未发现有致病力，与此观点一致。

参考文献

　　［1］赵锦. 初治菌阳病例短程化疗对武汉市疫情控制的作用. 中国防痨杂志，1995，17：4-6.

　　［2］刘祥荣，肖成志，李拯民，等. 肺结核化疗后复发及其影响因素研究. 中华结核和呼吸杂志，1993，16：69-72.

　　［3］高东哲，李京生，赵亭. 北京地区111株未经治疗新分离出结核菌株毒力测定结果分析. 中国防痨通讯，1989，11：117.

　　［4］卢润生，漆浩珊，王光述. 结核菌实验动物探讨. 中国防痨通讯，1990，12： 118.

　　［5］赵莉，苏建年. 新登记肺结核病例痰菌检查结果分析. 中国防痨杂志，1997，19：87.

　　［6］Canetti G. The tubercle bacillus in the pulmonary lesion of man. New York：Springer Publishing Co. Inc.，1955.195.

　　［7］Dickinson JM，Mitchison DA. Bactericidal activity in vitro and in the guinea-pig of isoniazid，rifampicin and ethambutol. Tubercle，1976，57: 251-258.

　　［8］Grosset J. The sterilizing value of rifampicin and pyrazinamide in experimental short-course chemotherapy .Tubercle，1978 ,59:287.

　　［9］Youmans GP. Tuberculosis. Philadelphia:Saunders，1979. 322.

　　［10］李国利，庄玉辉. 结核菌L型在豚鼠体内诱导的研究. 中华结核和呼吸杂志， 1990，13：351-354.

　　［11］庄玉辉，李国利，张晓刚. 抗酸菌L型（变异）分离培养方法的研究. 微生物学通报，1991，18：348.

　　［12］Gillespie SH ，Kennedy N. Fluoroquinolones ：a new treatment for tuberculosis? Inter J Tuberc Lung Dis，1998,2:265-271.

　　［13］汪谋岳. 耐药结核病处理指南简介.中华结核和呼吸杂志， 1998，26：381-383.

　　［14］朱莉贞. 耐药结核病的治疗. 中华结核和呼吸杂志，2000，23：77-78.

(收稿日期：1999-11-19)