肺结核患者肺灌洗液细胞分泌γ干扰素和白细胞介素12的变化

中华结核和呼吸感染 2000年第9期第23卷 论著

作者：钟定　董临江　梁庆祥　张小蔓　王立军　黄霖　徐效峰　刘喜林

单位：518101 广东省深圳市宝安区人民医院内科

　　关键词： 结核，肺；γ干扰素；白细胞介素12；白细胞介素4

　　【摘要】　目的　探讨肺结核患者支气管肺泡灌洗液细胞分泌细胞因子水平的变化及其对临床表现的影响。方法　分别对10名健康志愿者、10例肺结核患者健侧肺、10例轻症初治和10例迁延不愈的肺结核患者病变肺局部进行了支气管肺泡灌洗，获取肺泡巨噬细胞（AM）和淋巴细胞， 用双抗体夹心酶联免疫吸附法分别测定了经脂多糖刺激AM培养上清液中白细胞介素12(IL-12)和经植物血凝素刺激的淋巴细胞培养上清液中的γ干扰素（IFN-γ）和IL-4水平。结果　轻症组的IFN-γ和IL-12水平分别为(834±101)和（294±73）ng/L，不但明显高于健侧肺组［（197±59）和（67±23）ng/L，P均＜0.01］及健康对照组［(179±51)和（57±24)ng/L，P均＜0.01］， 也明显高于迁延组［(431±169)和（121±63) ng/L，P均＜0.01］；迁延组的IFN-γ和IL-12水平明显高于健侧肺组和正常对照组（P均＜0.01）；四组间IL-4水平差异无显著性（P均＞0.05）。结论　肺结核病人病变肺局部存在TH1型细胞免疫反应，该反应也许与AM产生的IL-12密切相关， 肺结核病灶局部产生的IFN-γ和IL-12水平影响肺结核的临床表现。

Alteration of interferon-gamma and interleukin-12 released by bronchoalveolar lavage cells from pulmonary tuberculosis

ZHONG Ding，DONG Linjiang，LIANG Qingxiang，et al.

　　（Department of Internal Medicine，The Baoan People′s Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518101,China）

　　【Abstract】　Objective　To explore the change of cytokine released in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) cells from pulmonary tuberculosis (TB) patients.Methods BALF cells were obtained from group A: 10 normal control volunteers (normal control group); group B: 10 radiographically uninvolved sites of pulmonary TB patients (uninvolved sites group); group C: radiographically involved two lobes of lung and smear-positive of 10 pulmonary TB patients with an onset less than one year; and group D: radiographically involved more than three lobes and smear-positive of 10 pulmonary TB patients with an onset longer than two years. The IFN-γ and IL-4 production in the culture supernate of BALF lymphocytes stimulated with PHA and IL-12 production in the culture supernate of BALF macrophage (AM) stimulated with lipopolysaccharide were determined using sandwich ELISA.Results In group C，the IFN-γ and IL-12 levels ［(834±101) and （294 ±73）ng/L，respectively］ were not only significantly higher than those of the group B［(197±59) and （67±23)ng/L，respectively，all P＜0.01］ and normal control group［(179±51) and （57±24) ng/L，respectively，all P＜0.01］，but also significantly higher than those of group D ［(431±169) and （121±63) ng/L，respectively，all P＜0.01］; in group D，the IFN-γ and IL-12 levels were significantly higher than those of the group B and normal control group (all P＜0.01); there were no significant differences between the group C and normal control group (P＞0.05); no differences were seen in IL-4 level among the 4 study groups.Conclusions A TH1 type response occurs in involved sites of pulmonary TB patients and that may result from AM which as a regulator through production of IL-12，and the TH1 type response may affect presentation and outcome in pulmonary TB.

　　【Key words】　Tuberculosis，pulmonary；　Interferon-gamma；　Interleukin-12；　Interleukin-4

　　80年代中期以来，结核病发病率呈回升趋势，其中机体免疫功能失调是其原因之一。结核病最易侵犯的器官是肺，但对肺结核病变局部细胞免疫反应情况尚知之不多，可能因未能对吸烟习惯、局部病灶、治疗与否和灌洗部位等情况进行很好控制，一些研究报告结果并不一致^［1］。我们对20例不吸烟的、病变程度不同的肺结核患者病变肺局部病灶进行了支气管肺泡灌洗（BAL)，分析了支气管肺泡灌洗液（BALF ）内肺泡巨噬细胞（AM）培养上清液中白细胞介素（interleukin,IL)12和淋巴细胞培养上清液中γ干扰素（interferon-gamma，IFN-γ）及IL-4水平，结果报道如下。

　　对象与方法

　　一、对象

　　所有对象均为不吸烟者，在检查前3 个月内均未用过皮质类固醇类药物。全部对象在接受BAL前均已被告知整个纤维支气管镜（纤支镜）检查包括BAL、刷检等操作过程的详细内容及可能出现的不良反应，并均已取得个人及家属的知情同意。

　　1.肺结核病灶组：20例，其中18例为先经痰液涂片阴性、后作纤支镜肺灌洗检查经BALF和（或）其后留痰涂片和（或）培养找到结核分支杆菌者，2例为原有痰菌阳性但有过抗结核史，虽然来诊时痰液涂片阴性但胸片示病灶有扩大者，其中按病情轻重、病程长短及曾否治疗又分为轻症组和迁延组两组进行比较。轻症组10例，男6例，女4例，年龄（30±9）岁，发病时间在8个月以内，X线胸片示浸润灶均累及一侧肺的两个肺叶，均无抗结核治疗史；迁延组10例，男6例，女4例，年龄（37±16）岁，病情迁延不愈，发病时间在2年以上，X线胸片示病灶均累及3个肺叶以上，均有过规则或不规则抗结核治疗史。

　　2.对照组：20例，其中分为健康对照组和结核健侧肺组两组以利比较。健康对照组10例，男7例，女3例，年龄（30±15）岁，为近3个月内无呼吸系统疾病史， 经病史询问、体格检查、胸部X线摄片、纤支镜检查均无异常发现的健康志愿者；结核健侧肺组10例，男7例，女3例，年龄（34±13）岁，均为在体检时胸部X线摄片发现左或右上肺有浸润影，痰液、BALF结核分支杆菌检查阴性，但后来追踪治疗效果显示规则抗结核治疗后肺部阴影明显减少或消失者。

　　二、方法

　　1.灌洗部位：各组均选取右肺中叶或左肺舌叶作为灌洗部位以获取BALF细胞，结核健侧肺组选取X线胸片上无浸润病灶一侧；肺结核病灶组无论迁延组或轻症组，均选取有浸润病灶一侧，并于灌洗后立即酌情注入100～200 mg异烟肼注射液。

　　2.BALF细胞的获取和分离：严格由纤支镜技术娴熟者专门进行，按照日本BAL 有关指针方案进行操作。简言之，用150 ml无菌生理盐水分3次通过经纤支镜插入的灌洗导管轻柔灌入支气管肺泡内，然后用注射器缓慢回吸收，回收液＞40％为回收成功，经双层纱布过滤， 用RPMI-1640培养液重新悬浮，Ficoll-Hypaqhe常规分离单个核细胞置于96孔平底板，37 ℃孵1 h，先收集非粘附的淋巴细胞，再用磷酸盐缓冲溶液(PBS)轻吹板壁收集AM， 二者均分别以含10％小牛血清的RPMI-1640液调细胞至1×10⁶/ml,前者加植物血凝素（PHA，美国Sigma公司产品）100 μg/ml、后者加脂多糖（LPS，Sigma公司产品）10 μg/ml，均于37 ℃、5％ CO₂培养48 h后分别收集上清液，贮于-20　℃准备用于IFN-γ、IL-4和IL-12检测。

　　3.细胞因子的检测：均采用双抗体夹心酶联免疫吸附（ELISA）法，IFN-γ试剂盒购自美国ENDOGEN公司；IL-4试剂盒和IL-12 P70试剂盒均购自美国Genzyme公司，所有操作步骤均按各试剂盒内所附说明书进行。

　　4.统计学处理：数据以±s表示，经方差齐性检验后用t检验。

　　结果

　　正常对照组、结核病患者健侧肺组、轻症组和迁延组BALF细胞培养上清液中各细胞因子水平见表1。20例对照组和20例肺结核病灶组细胞因子水平比较结果见表2。

表1　四组受检者BALF细胞培养上清液中细胞因子水平

　　比较(±s,ng/L)

　　注：^*与正常对照组比较P＜0.01；^▲与结核健侧肺组比较P＜0.01；^△与结核轻症组比较P＜0.01

表2　对照组与肺结核病灶组BALF中细胞因子水平

　　比较(±s，ng/L)

　　讨论

　　在抗结核免疫中，T细胞尤其是T辅助（TH）细胞及其释放的细胞因子起着重要的作用^［2］。研究表明， 在T细胞整体水平上，细胞因子分泌谱有TH1或TH2型细胞因子存在的格局，分泌IFN-γ是TH1细胞的特征而TH2以分泌IL-4最富代表性，当机体受特定抗原刺激时，这些细胞因子有产量上极化（polarization）的调控，而TH1和TH2细胞实质上就是TH细胞发生极化的结果，这种极化将满足机体对不同抗原刺激应答的实际需要^［3］。一些观察显示，结核病人TH1型细胞因子占优， 以满足机体对结核抗原刺激应答的需要^［3，4］，但在对病情严重程度不同和外周血及肺局部不同部位进行观察后，不同的作者有不同的结果^［1，5］。 我们比较严格地选取了四个观察组进行BALF细胞培养上清液细胞因子的分析，就是为了直接观察肺结核病灶局部究竟有无TH型细胞因子的变化及其与病变程度的关系。对包括轻症组和迁延组在内的肺结核病灶局部及包括正常对照组和肺结核健侧肺在内的健康肺BALF细胞培养上清液的分析结果显示，肺结核病灶局部AM分泌的IL-12水平升高，淋巴细胞分泌的IFN-γ水平增高而IL-4无改变，这显示肺结核病灶局部有TH1 型细胞因子升高，说明宿主免疫系统是通过向TH1型细胞极化来满足机体对结核抗原刺激的应答。Taha等^［6］认为此目的是为了阻止疾病的发展，不少研究都认为IFN-γ和IL-12对防御分支杆菌感染是必不可少的^［7］，而肺结核患者肺损害的程度似与这些细胞因子的水平有关^［8］。

　　在本研究中可看到，病程相对较长、有过抗结核治疗效果不佳历史、累及肺野较广的迁延组，其病灶局部IFN-γ和IL-12水平虽也高于对照组，但却明显低于轻症组。其中病情最重的是一位28岁的年轻医务人员，从山区考入某医校，3年后发现患肺结核，自诉经2次规则抗结核治疗，病灶仍在发展，因当地痰涂片阴性而来就诊。胸片示左肺全肺及右上中肺野都有浸润病灶，经纤支镜肺灌洗检查，支气管刷检物、BALF涂片及培养结核分支杆菌均阳性，其IFN-γ及IL-12水平分别是36 ng/L和146 ng/L，在20例结核病人中是最低的，仅与正常对照者相当。提示在某些较严重肺结核病人，结核抗原的刺激并未能充分诱发TH1 型细胞因子在产量上极化的调控，以致未能满足机体对结核抗原刺激应答的需要，从而削弱了防御反应，这极有可能是病变迁延不愈的原因之一。当然，这其中尚有许多工作要做。轻症肺结核健侧肺中各细胞因子无改变，一方面说明未受结核抗原刺激的正常肺组织中局部细胞免疫反应尚未被激活；另一方面，参照病灶组细胞因子的变化，也说明局部细胞免疫被激活是一个从无到有的渐进过程。

　　AM分泌的IL-12对IFN-γ起着重要的调节作用，当结核分支杆菌进入支气管树即被AM吞噬，AM通过将抗原提呈到T 淋巴细胞和分泌IL-12等活性物质引起免疫反应^［9］，IL-12作用的主要靶细胞是T淋巴细胞，可有效促进IFN-γ的产生，而IFN-γ对AM又有一个正反馈调节，可促进IL-12的分泌。这种良性循环的正常进行，可有效防止结核分支杆菌的侵袭^［9］。在本研究中，轻症组的IL-12和IFN-γ的水平是最高的，提示在正常情况下，侵入的结核分支杆菌被吞噬后，引发AM和T细胞间的正反馈调节机制，使IL-12和IFN-γ均有效升高， 从而加强了机体对结核的防御保护作用，反之，若入侵的结核分支杆菌未能有效诱发AM与T 细胞之间的正反馈机制，则可能削弱防御机制，使肺部病变迁延不愈，加重肺组织的破坏。本组迁延组，尤其是那例28岁年轻人IL-12和IFN-γ水平明显低于轻症组的现象支持这一点。从IL-12水平不高的情况考虑， 免疫缺陷环节可能在抗原提呈细胞水平，已有对低IFN-γ的重症肺结核给予IL-12后可有效提高IFN-r水平的报道^［10］，个中机制、效果及各方面的利弊有待深入研究。

　　BAL技术应用于肺结核病人虽比其他病人更要注意其安全性，但国外近10年来应用BAL研究活动性肺结核一直未中断过^{［1，4，6，9，11］}，且主张对痰涂片阴性者行BAL检查^［11］。我们认为，术前麻醉好、由技术娴熟者专人操作，使用灌洗导管以注射器轻柔注入、缓慢回吸收及尽量不用吸引器吸引，可有效避免呛咳及粘膜损伤出血，灌完后立即从导管中注入异烟肼，同时立即开始规则抗结核治疗或增加每周2次纤支镜下注入异烟肼等药物，不但可有效防止结核病灶扩散，也可有效辅助对肺结核的诊治。但整个操作过程必须十分谨慎，严防不当操作引起呛咳、出血和播散。

　　基金项目：广东省重点科技攻关项目（1998045）

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(收稿日期：2000-04-14)