溶血离心培养法检测肺结核患者外周血分支杆菌及其L型

中华结核和呼吸感染 2000年第9期第23卷 论著

作者：朱明利　黄礼年　夏佩莹　张元和　林特夫　王恩举

单位：朱明利 黄礼年（233004 蚌埠医学院附属医院呼吸科）；夏佩莹　张元和　林特夫　王恩举（蚌埠医学院微生物学教研室）

　　关键词： 结核，肺；外周血；分支杆菌；L型

　　【摘要】　目的　建立一种自血液中分离分支杆菌及其L型的新方法。方法　肺结核患者的外周血直接或溶血离心后取沉淀种入92-3TB和92-3TBL液体培养基培养，培养物用免疫酶染色（ABC法）鉴定。结果　65份标本分支杆菌和分支杆菌L型血培养的阳性率、总检出率分别为15%、26%、32%；溶血离心培养法的阳性率明显高于直接培养法（P＜0.05）；相应痰培养中，抗酸杆菌和抗酸菌L型的阳性率、总检出率分别为38%、20%和52%，高于肺结核患者外周血培养的阳性率（P＜0.05）；但血、痰配对检测总阳性率可达65%。结论　肺结核患者外周血存在分支杆菌及其L型，并以L型为主；溶血离心液体培养结合免疫酶染色可常规用于检测血液中分支杆菌及其L型；结合痰标本检测，可提高肺结核患者细菌学检查的阳性率。

Detecting mycobacteria and their L-forms in peripheral blood from pulmonary tuberculosis patients by cultivation with hemolyzed-centrifugated blood in liquid medium

ZHU Mingli，XIA Peiying，ZHANG Yuanhe，et al.

　　（The Central Laboratory of the Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu 233004， China）

　　【Abstract】　Objective　To establish a new method of detecting mycobacteria and their L-forms in blood.Methods 65 samples of peripheral blood from patients with pulmonary tuberculosis were cultivated directly or cultivated with hemolyzed-centrifugated blood sediments in 92-3TB and 92-3TBL liquid medium， and the cultures were staining with immunoenzyme technique (ABC method).Results In 65 specimens，the positive rates of mycobacteria and their L-forms were 15%，26% respectively with total isolation rate of 32%. In cultivating with hemolyzed-centrifugated blood the positive rate was much higher than direct cultural method (P＜0.05). In sputum the positive rates of acid-fast bacilli and their L-forms were 38% and 20% respectively，with total isolation rate of 52%, higher than that in peripheral blood (P＜0.05)， and the total positive rate of combinative detection of blood and sputum salmples was 65%.Conclusions Mycobacteria and their L-forms exist in peripheral blood of patients with pulmonary tuberculosis ，and mainly in L-forms. Cultivation with hemolyzed-centrifugated blood in liquid medium and staining with immunoenzyme technique are valuable in routine detection of mycobacteria and their L-forms in peripheral blood. The positive rate of bacterial culture of pulmonary tuberculosis could be increased in combination with sputum mycobacteria and their L-forms examination.

　　【Key words】　Tuberculosis，pulmonary；　Peripheral blood；　Mycobacteria；　L-form

　　1917年，Clough已报道从粟粒性结核患者的血液中培养出结核分支杆菌（简称结核杆菌）。近年来，采用聚合酶链反应（PCR）技术从肺结核患者外周血高比例检出结核杆菌核酸的报道较多，但缺乏相应的血培养依据。艾滋病患者常并发分支杆菌感染。80年代以来，国外已报道了多种专用于分支杆菌血培养的方法，如双相法、溶解离心法、放射呼吸测量法等^［1］。其中，溶解离心法处理血液可明显提高阳性率^［1］，结合液体培养基培养可明显缩短分支杆菌的血培养时间^［2，3］。而结核杆菌在血中可能以L型形式存在^［4］。为配合分支杆菌L型血行感染与致畸关系的研究，我们采用溶血离心后液体培养基培养法（简称溶血离心培养法），结合免疫组化技术，对血中分支杆菌及其L型的分离培养进行了探讨。

　　材料与方法

　　一、对象

　　根据临床表现、体征、胸部X线、CT及（或）痰细菌学检查确诊的肺结核患者65例，男39例，女26例，年龄13～75岁，其中痰检阳性者34例。20例健康对照为我院体检正常人。

　　二、实验试剂

　　培养基为蚌埠医学院微生物学教研室研制的92-3TB和92-3TBL液体培养基；免疫组化（ABC法，批号7032-1）和3，3′-二氨基联苯胺（DAB）试剂盒购于上海华美生物工程公司；兔源抗结核杆菌多克隆抗体（1∶100）由本院病理科汪万英教授惠赠；多聚赖氨酸购于福州迈新公司。

　　三、方法

　　1.所有患者和对照均采集3 ml静脉血，用肝素抗凝。痰标本1份加1 mol/L NaOH 4份，并加入灭菌酚红作指示剂，置37 ℃水浴中作用15 min，并不时用滴管吹打以助痰液消化，随即滴加1 mol/L HCL中和，3 000 r/min离心20～30 min，取沉淀接种培养基培养，15 d后取沉渣作厚涂片镜检。

　　2．血直接培养法：无菌条件下，分别取血0.3 ml接种于92-3TB和92-3TBL液体培养基，混匀后置于37 ℃培养，15 d后离心取沉渣涂片，抗酸染色后镜检，观察300～1 000个视野。抗酸菌L型阳性标准为查见抗酸染色阳性的圆球体、巨型体、原生小体、丝状体或抗酸颗粒。抗酸或非抗酸细菌疑为L型者按方法4处理后进行免疫组化鉴定。

　　3．溶血离心培养法：参照文献［2，3］，有改进。取余下的抗凝血转入自制溶血管，溶血后立即3 000 r/min离心30 min，各取沉淀约0.3 ml接种上述培养基，37 ℃ 15 d培养，离心后取沉渣镜检。

　　4．直接和溶血离心培养物均用甲醇∶冰乙酸(3∶1)预固定，5 min后3 000 r/min离心20 min，沉淀重复固定2～3次。最后加入上述固定液数滴，混匀后再从冰箱中取出冷的玻片（玻片事先用粘附剂多聚赖氨酸处理）上滴片，立即烤干。抗酸、免疫酶染色。

　　5．为排除高渗培养对分支杆菌L型检测的影响，每位病人另取2 ml血，溶血后用甲醇∶冰乙酸(3∶1)预固定，余按方法4进行处理（直接滴片法）。

　　6．免疫酶染色(ABC法)：(1)涂片用磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗5 min后，再用0.3％过氧化氢孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶；（2）PBS洗3×5 min，以封闭剂加于切片，37 ℃湿盒中温育20 min；（3）加以稀释液配置的1∶3 000的抗结核杆菌抗体工作液，置湿盒4～8 ℃过夜；（4）PBS洗3×5 min，加以稀释液配置的生物素化二抗工作液，置37 ℃湿盒中温育30 min；(5）PBS洗3×5 min，加ABC复合物37℃湿盒中温育30 min；（6）PBS洗3×5 min后，DAB显色，阳性者呈黄～棕黄色，阴性则不显色；(7）复染封片；（8) 实验中以10 g/L牛血清白蛋白替代一抗、三羟甲基氨基甲烷（Tris）盐酸缓冲溶液（TBS）替代二抗作为阴性对照，并以本室保存的结核杆菌及痢疾杆菌D15型标准株分别作为阳性和阴性对照。

　　结果

　　65例血培养中共有21例阳性(32%)。分别检有分支杆菌和分支杆菌L型10例和17例，其中分支杆菌伴L型者6例，分支杆菌及其L型的阳性率分别为15%和26%。65例血培养标本中，分支杆菌量少，分支杆菌或抗酸L型常伴有非抗酸L型或非抗酸颗粒（图1），直接滴片法可直接查见血中有分支杆菌和多种形态的抗酸L型或非抗酸L型，L型常成堆存在。20例对照的直接培养法和溶血离心培养法结果均未检出有分支杆菌及其L型。

图1　肺结核患者外周血中的分支杆菌伴非抗酸颗粒，培养法　抗酸染色　×1000

　　溶血离心培养法和直接培养法阳性率分别为29%和15%，符合率为80%，经配对的χ²检验，χ²=4.923，P＜0.05(表1)。其中有2例镜检为非抗酸L型，经免疫酶染色确认为分支杆菌L型（图2）。

表1　65例肺结核患者外周血分支杆菌及其L型

　　两种培养法结果比较

　　注：两种培养法结果比较χ²=4.923，P＜0.05

图2　免疫酶染色阳性的非抗酸分支杆菌Ｌ型，ABC法　DAB显色　×1000

　　痰培养中，典型抗酸杆菌和抗酸菌L型分别检见25例和13例，阳性率分别为38%和20%，总检出率为52%。与外周血培养结果配对比较，χ²=4.966，P＜0.05。外周血与痰标本的检测结果符合率为55%，总阳性率为65%(表2)。

表2　65例肺结核患者外周血和痰中分支杆菌及其L型

　　的配对检测结果

　　注：血、痰标本配对检测结果比较χ²=4.966，P＜0.05讨论

　　与痰等标本相比，血液具有污染机会少、可免除前处理、可定量 、可保护检验者免受感染的优点，并可解决取痰质量难控制 、部分患者（如小儿）无法留痰的问题。近年来，国内外有大量采用PCR技术检测肺结核患者外周血结核杆菌DNA的报道，提示肺结核患者病灶内的结核杆菌可能进入血液或其致敏的细胞中，但缺乏相应的血培养依据。国外已报道了多种专用于分支杆菌血培养的方法。其中，溶解离心法可明显提高阳性率2～5倍。但未见应用于肺结核患者外周血中分支杆菌及其L型检测的报道。与文献报道相似，本组溶血离心培养法的阳性率明显高于直接培养法。与国外传统的溶解离心培养法（又称isolatosystem)相比，不需专用离心机和isolator管，简化了方法，适合常规应用。

　　与其他细菌一样，结核杆菌在不利环境中受物理、化学（药物）及免疫学因素的影响，细胞壁发生缺陷型变异，形成L型菌^［5］。理论上，血液里含有较高浓度的药物、免疫因子及多种免疫活性细胞，有利于分支杆菌L型的形成和持续存在。本研究发现，肺结核患者外周血存在分支杆菌及其L型，而尤以L型为主，L型形态各异，染色不定。已知免疫酶染色有很高的敏感性和特异性，方法快速简便。本组有2例肺结核患者外周血培养物为非抗酸L型，而ABC法阳性。培养物经甲醇∶冰乙酸多次固定后，因多次漂洗，免疫组化背景的非特异染色大大降低。而溶血离心液体培养结合免疫酶染色是比较理想的检测血中分支杆菌及其L型的方法，并且可同时检测血中的非抗酸分支杆菌L型。

　　有作者报道，液体培养基与固体培养基相比，可明显缩短艾滋病人外周血中鸟分支杆菌和结核杆菌的检出时间^［2，3］，这可能是由于液体培养基扩大了分支杆菌及其L型与营养物质的接触面，所以增殖速度较快。戴云海等^［6］曾运用该培养基检查了766例可疑结核患者的痰、脑脊液等标本，结果细菌型、L型、总检出率分别达到36.1%、43.6%、57.8%。我们采用溶血离心后液体培养基培养法，肺结核患者外周血分支杆菌及其L型的总检出率为32%，相应痰培养为52%；两种标本结合检测总阳性率可达65%，表明两种标本同时检测可提高阳性率，而血标本检测尤其适合于无痰和小儿患者。

　　基金项目：安徽省自然科学基金资助项目(95-医-15）

参考文献

　　［1］林听宝.分枝杆菌菌血症的血液培养.国外医学临床生物化学与检验学分册，1990，11:8-11.

　　［2］Jacomo V, Musso D, Gevaudan MJ, et al. Isolation of blood-borne Mycobacterium avium by using the nonradioactive BACTEC 9000 MB system and comparison with a solid-culture system.J Clin Microbiol，1998，36:3703-3706.

　　［3］Tholcken CA, Huang S, Woods GL. Evaluation of the ESP culture system Ⅱ for recovery of mycobacteria from blood specimens collected in isolator tubes. J Clin Microbiol，1997， 35:2681-2682.

　　［4］黄谷良, 林特夫, 郭秉兰, 等编著. 细菌L型与疾病. 北京：学苑出版社，1991.331-346.

　　［5］庄玉辉. 结核病实验室诊断新技术研究应用中值得重视的问题. 中华结核和呼吸杂志，1999，22:133-134.

　　［6］戴云海, 李明君, 林特夫. 临床标本结核分枝杆菌及其L型的液体培养与检出. 贵州医药, 1995，19:320-322.

(收稿日期：2000-02-13)