PIG-A基因突变与阵发性睡眠性血红蛋白尿症

　　中华血液学杂志CHINESE JOURNAL OF HEMATOLOGY

　　1999年第20卷第11期vol.20No.11 1999

赵明峰　陈桂彬　邵宗鸿

　　 关键词：阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH） pIG-A基因 GPI锚连蛋白

　　阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）是一种获得性克隆性造血干细胞疾病，临床表现多样，以持续性血管内溶血，阵发性加重为主要特征。业已证明，PIG-A基因突变而导致糖化磷脂酰肌醇（GPI）合成障碍，致使血细胞GPI锚连蛋白缺失，是引起PNH溶血等临床表现的主要原因。PIG-A基因突变及其引起GPI锚连蛋白的缺失在PNH发病、诊断及治疗方面的作用已越来越受到重视。

　　1　PIG-A基因的概况　PIG-A基因位于染色体Xp22.1上，全长约17 kb，编码含484个氨基酸的蛋白产物。编码区由1 452 bp组成，共有6个外显子，其中外显子1含5′非翻译区的一部分，外显子2含5′非翻译区的剩余部分和大约一半的编码区，3′非翻译区位于第6外显子的3′端（约2.1 kb），外显子1至其上游583 bp之间为启动子区，其中有4个CAAT盒，2个AP-2序列，以及1个顺式调控元件。这些序列对PIG-A基因的表达非常重要^［1］。PIG-A基因参与了GPI生物合成的第一步：GlcNAc-PI(N-乙酰葡糖胺-磷脂酰肌醇)和GlcN-PI(N-葡糖胺-磷脂酰肌醇)的合成。GPI是在内质网中合成的。首先是GlcNAc(N-乙酰葡糖胺)从UDP-GlcNAc转移至PI，生成GlcNAc-PI，脱乙酰基后生成GlcN-PI，再加甘露糖，然后再加磷酸乙醇胺，最后经过修饰而成。在整个合成过程中至少有10个基因参与，其中第一步还有另外2个基因PIG-C、PIG-H，其它步骤中有PIG-B、PIG-G、PIG-F等^［2］。

　　突变的细胞杂交实验可使GPI缺陷得到纠正，证明单一的PIG-A基因突变即可引起PNH表型^［3］。目前的研究表明，在所有已检测的PNH患者血细胞中，都发现有PIG-A基因突变而导致GPI锚连蛋白的部分或全部缺失，说明PIG-A基因突变在PNH发病中有重要作用^［4］。实际上，参与GPI合成的基因很多，包括PIG-B、PIG-C、PIG-F、PIG-H等，但它们均位于常染色体上，一次突变不足以引起PNH表型。PIG-A基因位于X染色体上，由于人类在胚胎发育中，两条X染色体的一条发生了随机灭活，故PIG-A基因一次突变即可导致PNH表型，这也可能是检测到PNH突变基因均为PIG-A的原因^［5］。

　　2　PNH中PIG-A基因突变的情况　PNH的PIG-A基因突变为异质性的，突变位点各不相同。Nafa等^［6］总结了20篇报道中105例PNH患者的总共123种PIG-A基因突变的情况。在这105例患者中，46例有典型的溶血症状，29例为再生障碍性贫血-PNH（AA-PNH）综合征，30例未分类。在123种突变中，112种只被检测到1次，11种多次被检测到。报道了3种突变有大的缺失，其中1例整个PIG-A基因缺失；1例有包括外显子3，4，5共4 kb的缺失；1例缺失了737 kb，包括一部分启动子，整个外显子1和部分内含子1。70种突变导致移码（45种为小的缺失，16种为小的插入，6种为缺失/替换，3种为插入/重复）。14种无义突变。12种突变破坏了拼接位点（10种为核苷酸的替换，1种为单一核苷酸的缺失，1种为1，2核苷酸的缺失）。因此，总共99种突变可导致PIG-A蛋白功能的全部丧失。另外24种突变（22种为错义突变，2种为框架缺失的突变）可导致PIG-A蛋白功能的部分或全部丧失。在所有突变中，移码突变占大部分。在欧洲人中发现了一种遗传性的第2外显子单一核苷酸的替换（C 55→T），其发生率约为6%。有典型溶血症状的PNH和AA-PNH综合征相比，PIG-A基因的突变谱无明显不同。作者还注意到虽然PIG-A基因突变可发生于编码区的任何部分，但错义突变发生于第2外显子较发生于其它外显子的比例高。然而，整个PIG-A基因并没有“热点”突变区域。

　　根据GPI锚连蛋白在血细胞上的表达不同，可将PNH患者的血细胞分为三种：PNHⅠ型细胞（GPI锚连蛋白表达正常），PNHⅡ型细胞（GPI锚连蛋白部分缺失），PNHⅢ型细胞（GPI锚连蛋白完全缺失）。有研究表明，PNHⅡ型细胞也可检测到PIG-A基因的突变，但其突变多为点突变，因而推测这些点突变可能导致PIG-A蛋白的活性部分丧失而产生PNHⅡ型细胞^［7］。另外，发现在PNHⅢ型细胞中，PIG-A基因的无效突变较PNHⅡ型细胞为多^［6］。

　　Kawaguchi等^［8］分析了40例PNH患者外周血细胞中CD₅₅、CD₅₉的表达情况，发现27例（67%）患者PNHⅡ型和Ⅲ型细胞共存，提示这些患者有一种以上的PIG-A基因突变，且可能有多个PNH克隆。而Nishimura等^［9］统计了直接检测PIG-A基因的结果表明，同时有多个不同的PIG-A基因突变的PNH患者的比例约为20%，而且通常只有一种克隆占优势。

　　值得指出的是，PIG-A蛋白仅作为催化剂参与GPI的合成，故PIG-A蛋白仅有部分活性就可产生大量的GPI，因此，许多PIG-A基因的错义突变并不能产生PNH表型^［10］。

　　Norris等^［11］初步研究了PIG-A基因突变位点的不同对PIG-A蛋白结构和功能的影响。作者分析了18例PNH患者PIG-A基因的错义突变，发现有6例位于编码子128～129和151～156上，这些编码子位于小鼠和酵母PIG-A同源基因的高度保守的区域内，因此，猜想这些编码子可能编码PIG-A蛋白的关键部分。作者用点诱变的方法，获得具有这些编码子突变的PIG-A的cDNA，分别转入原核及真核表达系统，测其PIG-A蛋白的结构及功能。结果表明，编码组氨酸128（H 128）、丝氨酸129（S 129）和丝氨酸155（S 155）的编码子发生错义突变可导致PIG-A蛋白功能的部分丧失，而发生于编码侧链氨基酸残基的编码子的错义突变对PIG-A蛋白功能无影响。提示编码H 128、S 129和S 155的编码子是影响PIG-A蛋白功能的关键部分。

　　3　PIG-A基因突变与GPI锚连蛋白在PNH血细胞中的表达　GPI锚连蛋白有很多种，但CD₅₅、CD₅₉存在于所有系列的血细胞中，且与临床表现密切相关，故将这两种蛋白作为PNH克隆的标记。PNH为一种克隆性造血干细胞疾病，自多能干细胞至各系成熟血细胞都有GPI锚连蛋白缺失，但各系列受累及的程度不同。

　　Terstappen等^［12］的检测结果表明，PNH患者骨髓中的造血干细胞（CD₃₄⁺CD₃₈^-）主要为CD₅₅^-、CD₅₉^-，但也有一小部分为CD₅₅⁺、CD₅₉⁺的正常细胞。两群不同的细胞各自分化成熟，致外周血中的各系血细胞也主要分为两群。在PNH缓解后，骨髓中PNH表型的造血细胞被正常的造血细胞所取代。有的研究表明，虽然PNH患者骨髓中的CD₃₄⁺细胞大部分为PNH表型的细胞，但外周血中的CD₃₄⁺细胞仍是正常的，经过粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员后，动员出的多为正常的造血干细胞。认为这为PNH患者行自体外周血干细胞移植提供了思路^{［13，14］}。但最近的一项研究表明，虽然PNH患者的外周血造血干细胞PNH表型是正常的，但经G-CSF动员出来的主要为具有PNH表型的造血干细胞^［15］。

　　Navenot等^［16］检测了16例PNH患者外周血中红细胞、粒细胞、血小板、单核细胞的CD₅₅、CD₅₉的表达。发现所有系列的血细胞均有两种蛋白表达不同程度的缺失，每个患者缺失程度不一。但是，红细胞缺失程度显然要较粒细胞、血小板为低。Pakdeesuwan等^［17］分析了9例PNH患者PIG-A基因突变与GPI锚连蛋白表达之间的关系，发现9例患者均有PIG-A基因突变，61.5%为移码突变。所有患者均有50%～100%的粒细胞完全缺失CD₅₅，而4例患者的红细胞的CD₅₅、CD₅₉表达完全缺失、部分缺失和正常的三群细胞共存。以上结果提示PNH患者都有PIG-A基因突变，但红系GPI锚连蛋白缺失程度少于粒系，其原因可能有：①红细胞寿命长，随时间推移具有PNH表型的红细胞被破坏，致使其比例减低；②具有PNH表型的红细胞较其它血细胞更易受到补体的破坏而溶血；③经常输注正常人的红细胞。由此可见，PNH患者外周血中中性粒细胞更能反映骨髓中PNH克隆的情况。Rabesandratana等^［18］研究发现，在网织红细胞分化为成熟红细胞过程中，其释放的囊泡中含有大量的GPI锚。此结果解释了PNH患者成熟红细胞GPI锚连蛋白表达少于网织红细胞的原因。

　　淋巴细胞的GPI锚连蛋白缺陷较其它系列要轻，其PNH克隆的出现较其它系列晚，但在外周血中维持的时间较长。甚至在PNH缓解后，外周血中粒、红细胞的PNH克隆消失后，淋巴细胞的PNH克隆仍可维持很多年^［19］。最近，Richards等^［20］进一步分析了19例PNH患者（18例活动性的，1例自发缓解）淋巴细胞亚群GPI锚连蛋白的表达情况，发现所有患者都有淋巴细胞亚群异常，较常见的异常为NK细胞、B淋巴细胞绝对数低于正常对照。具有GPI锚连蛋白缺失的B、T淋巴细胞及NK细胞的患者分别占所有患者的88%、84%和89%。大部分患者NK细胞GPI锚连蛋白缺陷细胞的比例高于B或T淋巴细胞。所有病例并无并发严重感染的情况。作者认为，T、B淋巴细胞由于经历了无效生成及阴性选择，使其GPI锚连蛋白缺陷细胞比例较低。PNH患者中淋巴细胞亚群的异常同体液免疫及感染的关系尚待进一步研究。

　　4　PIG-A基因突变与PNH克隆增殖优势　PNH克隆作为一种有缺陷的克隆（PIG-A基因突变，GPI锚连蛋白缺失），却能在PNH患者的造血生成中占据优势——有缺陷的PNH克隆生长，正常的造血干细胞受抑。PNH克隆究竟有无生长增殖优势 与PIG-A基因突变的关系是什么？是否还有其它因素参与？近年来部分学者对此作了初步的研究。

　　Lwamoto等^［21］将PNH患者骨髓的CD₃₄⁺细胞移植入用亚致死量放疗所致严重联合免疫缺陷的小鼠中，造血可维持10个月以上，而且不需要人的细胞因子的支持。而将正常人的骨髓移植入此种小鼠中，却需要大量的细胞因子的支持治疗才能维持造血。这个体内实验提示了PNH克隆有内在的生长增殖特性。Endo等^［22］报告了1例并回顾了4例行骨髓移植的PNH患者，这5例患者均未行骨髓预处理而输入同基因的正常骨髓，结果只有1例痊愈，其余4例无效或复发，间接证明了PNH克隆较正常造血干细胞有生存优势。

　　Brodsky等^［23］体外培养PNH患者的粒细胞及有缺陷（CD₅₉^-）的CD₃₄⁺细胞，其生存时间较正常对照长，同时对由电离辐射诱导的凋亡产生抵抗。作者利用LD^-和JY 5细胞株（具有PIG-A基因突变的B原始淋巴细胞株）为模型，进一步研究了PIG-A基因在PNH细胞生长增殖中的作用。当导入PIG-A的cDNA时，LD^-和JY 5细胞的凋亡增加，提示PIG-A基因突变导致了PNH克隆的生长增殖优势及凋亡抵抗。

　　但是，大多数学者认为单独的PIG-A基因突变并不能赋予PNH克隆以生长增殖优势。Rawstron等^［24］研究了8例用CAMPATHIH（anti-CD₅₂，CD₅₂是一种表达在淋巴细胞和单核细胞表面的GPI锚连蛋白）治疗的难治性慢性淋巴细胞白血病患者，治疗前检测到1例患者有少量T淋巴细胞具有PIG-A基因突变，但所有患者均未检测到GPI锚连蛋白阴性细胞；治疗后6例患者出现GPI锚连蛋白阴性的T细胞（CD₅₂^-、CD₅₅^-、CD₅₉^-），且测得90%的GPI锚连蛋白阴性的T细胞缺少GPI，另2例患者无GPI锚连蛋白阴性细胞。以上结果提示，部分“正常人”也可以存在PIG-A基因突变，但不能发展为PNH，说明PNH克隆要取代正常造血需要其它因素的参与。

　　Rosti等^［25］用同源重组的方法获得无PIG-A基因活性的小鼠胚胎干细胞（ES），ES可以造血，分化成熟为具有PNH表型的粒、红、淋巴细胞。作者发现，具有PNH表型的红细胞仅在胚胎中出现，出生后很快下降。同样，PNH粒细胞仅能在幼龄鼠中发现。在体外细胞培养中，ES可以分化为具有PNH表型的粒、红细胞，但其数量少于正常对照。说明单独的PIG-A基因突变并不能使PNH克隆具有生长优势。

　　Maciejewski等^［26］将17例PNH患者的CD₃₄⁺细胞分离纯化，发现其短期培养及长期培养的克隆形成能力均较正常对照下降。提示具有PIG-A基因突变的造血干细胞并无内在的生长增殖优势。Ware等^［27］检测了26例PNH患者外周血粒细胞的凋亡情况，发现其凋亡减少，但GPI锚连蛋白阴性的粒细胞比例低的患者同比例高的患者相比，凋亡率无明显区别。作者将PIG-A的cDNA导入JY 5细胞株，使GPI锚连蛋白稳定表达，测其对Fas抗原、γ射线诱导的凋亡抵抗，发现导入前同导入后无明显不同，提示凋亡抵抗同PIG-A基因突变无关。而Nafa等^［28］报告了1例行同基因骨髓移植后复发的PNH患者，移植前检测PIG-A基因在第6外显子有插入/重复突变而导致移码；复发后，PIG-A基因的突变变成了第2和第6外显子的单一核苷酸的替换。该患者未行骨髓预处理，复发后PNH克隆却发生了改变，提示PNH克隆的选择性生长受到一定因素的调控。

　　总之，越来越多的证据表明，单独的PIG-A基因突变并不能赋予PNH克隆以内在的生长优势，尚需外在环境因素选择性作用于GPI锚连蛋白缺乏的PNH细胞而使之较正常细胞有生长优势。导致正常造血干细胞损伤的因素可能有利于PNH克隆扩展^［10］。有作者检测到PNH患者血清中的红细胞生成素(Epo)及G-CSF水平高于正常对照，说明细胞因子也可能参与PNH的发病过程^［29］。最近，Bessler等^［30］综合文献分析了PNH克隆具有生长优势的可能机制，认为具有PNH表型的造血干细胞与正常的造血干细胞相比，有PNH表型的细胞对导致正常细胞死亡的因素有抵抗性，这种“死亡”的逃脱与PNH的表型有关：①GPI锚连蛋白的缺乏可能使PNH克隆对细胞因子的反应性发生改变，或使活化的T细胞不能对其识别；②GPI锚连蛋白（包括能粘附于骨髓基质的粘附分子）的缺乏，可能使PNH造血干细胞脱离骨髓微环境，而避免活化T细胞的损伤^［31］；③GPI锚连蛋白的缺乏可能影响细胞膜功能性的脂质性微区域（lipid microdomain）的形成，因而改变PNH克隆的生物学性能。但是，以上推测尚缺乏直接的实验证据，其确切机制有待进一步研究。

　　5　PIG-A基因与基因治疗　发现PIG-A基因突变作为PNH发病的主要原因，开辟了基因治疗PNH的思路。将正常PIG-A的cDNA导入PNH造血干细胞，使其恢复GPI锚连蛋白的表达，将可能使PNH得到治愈。很多实验已将PIG-A的cDNA成功导入PNH的B原始淋巴细胞株模型，并经培养后恢复表达GPI锚连蛋白^{［23，27］}。但仍有许多问题有待解决：①所有PNH患者即使其骨髓为高增生的，其造血干细胞的数量仍少^［26］，很难提供足够的基因治疗所需的靶细胞；②到目前为止，已构建的各种转基因载体还不能使PIG-A的cDNA有效地转入PNH的造血干细胞，使之持续稳定地表达GPI锚连蛋白；③PNH的发病不仅与PIG-A基因有关，而且与患者的骨髓微环境等外部因素有关，不去除外部因素，即使成功地将PIG-A的cDNA导入PNH造血干细胞，仍有可能复发或发展为再生障碍性贫血。因此，基因治疗PNH尚处于初级实验阶段，深入研究PIG-A基因突变及其它因素在PNH发病中的作用，将有助于PNH基因治疗的突破。

　　作者单位：300020　天津，中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院

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收稿：1999-03-04　修回：1999-05-20