中国人群2型糖尿病患者付氧酶基因多态性与冠心病关系的研究

中华内分泌代谢杂志 2000年第1期第16卷 论著

作者：尤蓓　于金德　陆林　乐玮　陶蓉　何汝敏　蔡煦　朱鼎良　龚兰生

单位：尤蓓（上海第二医科大学附属瑞金医院心内科)；于金德（上海第二医科大学附属瑞金医院心内科)；陆林（上海第二医科大学附属瑞金医院心内科)；乐玮（上海第二医科大学附属瑞金医院心内科)；陶蓉（上海第二医科大学附属瑞金医院心内科)；何汝敏（上海第二医科大学附属瑞金医院心内科)；蔡煦（上海第二医科大学附属瑞金医院心内科)；龚兰生（上海第二医科大学附属瑞金医院心内科)；朱鼎良（上海市高血压研究所)

　　关键词： 糖尿病，非胰岛素依赖型； 冠状动脉疾病； 聚合酶链反应； 付氧酶； 变性梯度凝胶电泳

　　摘　要：目的　探讨中国2型糖尿病患者付氧酶(PON)基因与并发冠心病(CAD)的关系。方法利用聚合酶链反应—变性梯度凝胶电泳技术对49例2型糖尿病合并CAD患者、49例未合并CAD的2型糖尿病对照者和101例健康对照者进行PON基因外显子筛查。结果　发现中国人群PON基因第191位密码子存在Gln¹⁹¹-Arg多态性，等位基因以A/B表示。CAD患者PON基因的3种基因型(AA、AB和BB)的构成比与2型糖尿病对照和健康对照差异有显著性，B等位基因频率较两对照组显著增高(0.79比0.62和0.61，均P＜0.01)。结论　中国2型糖尿病患者PON基因第191位密码子的Gln¹⁹¹-Arg多态性与并发CAD有关，B等位基因是2型糖尿病并发CAD的危险因素之一。

The relationship between paraoxonase gene polymorphism and coronary artery disease in type 2 diabetes mellitus in a Chinese population

YOU Bei　YU Jinde　LU Lin　et al

　　（Department of cardiology,Ruijin Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025）

　　Abstract：Objective　To ascertain the relationship between paraoxonase (PON) gene and coronary artery disease (CAD) morbidity in Chinese type 2 diabetes mellitus (type 2 DM) patients.Methods　The exons of PON gene were screened by polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis in 49 type 2 DM patients complicated with CAD, 49 CAD-uncomplicated type 2 DM as well as 101 healthy control subjects of Chinese population.Results　Gln¹⁹¹-Arg polymorphism of the PON gene was detected in Chinese with the A/B allele frequencies 0.39 and 0.61 respectively. The genotype distribution (AA, AB and BB) of the PON gene polymorphism was significantly different between type 2 DM patients complicated with CAD and controls (type 2 DM & healthy subjects), the former had a significantly higher B allele frequency (0.79 vs 0.62 and 0.61, P＜0.01).Conclusion　Gln¹⁹¹-Arg polymorphism of the PON gene is associated with CAD morbidity in Chinese type 2 DM patients and B allele might be a risk factor.

　　Key words：Diabetes mellitus, non-insulin dependent; Coronary disease; Polymerase chain reaction; Paraoxonase; Denaturing gradient gel electrophoresis▲

　　2型糖尿病和冠心病(CAD)均是多基因遗传性疾病，2型糖尿病又是CAD发病的独立危险因素。2型糖尿病患者大多伴随脂代谢异常，这一病理基础与并发CAD有关。近来研究血清中存在一种被称作付氧酶(paraoxonase, pON)的糖蛋白，它与较大的高密度脂蛋白(HDL)颗粒(即含apoA-I和apoJ的HDL)紧密结合。众多证据表明PON在体外能水解脂质过氧化物，减少LDL的氧化，对CAD发病有预防作用。本研究应用聚合酶链反应—变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术筛查PON基因全部外显子，以探讨我国2型糖尿病患者PON基因与并发CAD的关系。

　　对象和方法

　　一、对象

　　CAD合并2型糖尿病组49例，男28，女21，年龄(65.7±7.5)岁，除临床诊断陈旧性心肌梗死6例和急性心肌梗死1例外，其余均有冠状动脉造影依据；单纯糖尿病对照组49例，男27，女22，年龄(54.1±11.5)岁，临床上经询问病史、体检、实验室和心电图检查排除CAD；正常对照组101名，男59，女42，年龄(49.8±9.3)岁，为常规体检者，无CAD病史、体征、实验室检查及心电图依据。

　　二、实验方法

　　1.基因组DNA制备：采外周血5ml，溶解红细胞后，用蛋白酶K消化法和酚/氯仿抽提白细胞中基因组DNA。

　　2.聚合酶链反应(PCR)引物及条件：应用Bio-Rad公司MacMelt软件设计9对引物(表1)，扩增所有外显子及其两翼部分内含子序列，根据PCR扩增片段的模拟电泳解离行为，在一侧引物的5’端加由40G/C碱基组成的“GC-夹”，使PCR产物一端形成熔点(T_m)较高不易解链的“夹子”。在50μl PCR扩增体系中，基因组DNA 200～500ng，dNTP 0.2 mmol/L，引物0.15～0.45μmol/L，MgCl₂ 1.5～2.0 mmol/L，1×缓冲液(Tris-HCl 10mmol/L pH 8.3，KCl 50mmol/L，0.01%明胶)，Taq DNA聚合酶(Promega公司)1U。经94℃变性5分钟，再经94℃(变性)，45秒；51℃～62℃(退火)，1分钟；72℃(延伸)，1分钟，循环扩增35个周期，72℃继续延伸10分钟。

表1　PCR引物序列

　　Tab 1　Primer sequences of PCR

　　注：“GC-”=5' CGCCC GCCGC GCCCC GCGCC CGTCC CGCCG CCCCC GCCGC 3'　　3.变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析：灌制40%～70%变性梯度(以含7mmol/L尿素+40%甲酰胺溶液作为100%变性液浓度)的7.5%聚丙烯酰胺凝胶，上样后80V电泳16h，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果。

　　4.序列分析：割下DGGE纯合子型异常条带，溶于去离子水中，以浸润液内DNA为模板，用相同条件进行PCR再扩增。产物纯化后从正反链同时进行荧光末端标记自动测序。

　　5.统计学处理：根据Hardy-Weinberg平衡估计等位基因频率。组间基因型频率，等位基因频率比较采用R×C χ²检验，并进行危险度分析。

　　结果

　　通过PCR-DGGE技术，在中国人群中对PON基因9个外显子进行筛查，发现其第6外显子存在多态性。其中5例经PCR产物直接测序，证实是第191密码子发生A→G转换(CAA¹⁹¹→CGA)所致的Gln→Arg多态性(等位基因定义为A/B)，基因型分别为AA型(2例)、BB型(2例)和AB型(1例)。PON基因其他外显子未检测到异常条带。

　　以测序后明确序列的DNA扩增片段为DGGE电泳标记，分析电泳结果：仅出现一条带，与AA或BB型DNA片段泳动行为一致的认为是AA或BB基因型；出现4条带，且条带形状、分布与AB型DNA片段一致的则为AB基因型。

　　发现正常对照人群中A/B等位基因频率分别为0.39/0.61。2型糖尿病合并CAD组中AA、AB和BB基因型分别为2例、17例和30例；单纯2型糖尿病对照组各为7例、23例和19例；正常对照组各为14例、51例和36例。2型糖尿病合并CAD组与正常对照组和2型糖尿病对照组相比PON基因三种基因型分布差异有显著性(分别为P＜0.01和P＜0.05)；B等位基因频率显著增高(0.79比0.61和0.62，P＜0.01和P＜0.05)(表2)。

表2　2型糖尿病(DM)合并冠心病(CAD)组与对照组的付氧酶基因型比较

　　Tab 2Paraoxorase genotypes in type 2 diabetic mellitus

　　(DM) patients with coronary artery disease (CAD) and controls

　　注：CAD合并DM组与DM对照组相比 Group of CAD with DM vs group of DM control,P＜0.05；CAD合并DM组与正常对照组比较 Group of CAD with DM vs group of normal control, P＜0.01；DM组(98例)与正常对照组比较 Group of DM vs group of normal control, P＞0.05讨论

　　PON基因位于7q21-22，含9个外显子，8个内含子。在欧洲白种人中，发现PON基因存在191位密码子A→G转换(Gln¹⁹¹→Arg多态性)和54位密码子A→T颠换(Met⁵⁴→Leu多态性)。进一步研究显示，在2型糖尿病患者中Gln¹⁹¹→Arg多态性与血脂水平和并发CAD相关^〔1〕。已有的研究显示，结合在HDL上的PON蛋白能把脂质过氧化物水解成乙醇和羧酸，减少LDL氧化，预防动脉壁粥样硬化的发生或减缓其进程^〔2〕，在欧洲白种人中，A/B等位基因频率分别为0.71/0.29^〔3〕，B等位基因是CAD的一个独立危险因素^〔1，4〕。

　　我们应用PCR-DGGE技术对49例2型糖尿病合并CAD病例、49例单纯2型糖尿病病例和101例正常对照进行PON基因外显子筛查，证实中国人群中存在Gln¹⁹¹/Arg多态性，A、B等位基因频率分别为0.39和0.61，B等位基因频率明显高于欧洲白种人。未发现Met⁵⁴/Leu多态性。这表明PON基因多态性存在种族差异。

　　2型糖尿病患者与正常人群相比，A、B等位基因频率无显著差异。2型糖尿病合并CAD患者与正常对照和单纯2型糖尿病患者相比，则B等位基因频率显著增高(分别为χ²=9.28，P＜0.01和χ²=6.27，P＜0.05)，提示2型糖尿病患者中B等位基因与并发CAD的危险性增高相关(比数比2.22，95%可信区间为1.19～4.14，χ²=6.24,P＜0.05)。

　　PON蛋白通过疏水氨基端与HDL中的apo-I紧密结合^〔5〕。血循环中，PON活性的85%是由与HDL结合的PON体现，其余活性与脂蛋白无关^〔6〕。PON与HDL结合部位的构型对PON活性至关重要，有发现糖尿病患者中HDL构成发生变化，影响到PON的结合部位构型^〔7〕。Gln¹⁹¹/Arg多态性可能进一步改变了PON构型或使其与底物结合异常，使其对氧化LDL的水解能力下降，使LDL氧化增加促进糖尿病患者CAD的发生。■

　　 基金项目：“863”基金资助项目(102-10-02-03)；上海市科委重大基础研究项目基金资助(974119003)

　　参考文献：

　　［1］Ruiz J, Blanche H, James RW, et al. Gln-Arg¹⁹² polymorphism of paraoxonase and coronary heart disease in type 2 diabetes. Atherosclerosis, 1995,115(Suppl.):s13(abstr).

　　［2］Mackness MI, Arrol S, Abbott CA, et al. Is paraoxonase related to atherosclerosis. Chem Biol Interactions, 1993,87:161-171.

　　［3］Adkins S, Gan KN, Mody M, et al. Molecular basis for the polymorphism forms of human serum paraoxonase/arylesterase: glutamine of arginine at position 191, for the respective A or B allozymes. Am J Hum Genet, 1993,52:598-1068.

　　［4］Serrato M, Marian AJ. A variant of human paraoxonase/arylesterase (HUMPON) gene is a risk factor for coronary artery disease. J Clin Invest, 1995,96:3005-3008.

　　［5］La Du BN, Adkins S, Kuo CL, et al. Studies on human serum paraoxonase/arylesterase. Chem Biol Interactions, 1993,87:25-34.

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　　［7］Abbott CA, Mackness MI, Kumer S, et al. Serum paraoxonase activity, concentration and phenotype distribution in diabetes mellitus and its relationship to serum lipids and lipoproteins. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1995,15:1812-1818.