哮喘患者外周血T淋巴细胞凋亡及其分子机制

中华结核和呼吸感染 1999年第9期第22卷 论著

作者：薛建敏　徐永健　张珍祥　沈关心　熊盛道

单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院呼吸内科［薛建敏现在山西医学院附属第一医院呼吸科(030001)］；同济医科大学实验中心免疫室(沈关心)

　　关键词： 哮喘；T淋巴细胞；凋亡

　　【摘要】　目的　探讨哮喘患者外周血T淋巴细胞凋亡率的变化及其分子机制。方法　取12例急性发作期哮喘患者(哮喘组)及10名正常对照者(对照组)外周血淋巴细胞并无菌分离T淋巴细胞, 采用电镜和原位末端终止法（TUNEL）观察抗CD⁺₃单抗(100 mg/L)诱导体外培养0、24、48、72小时后T 淋巴细胞凋亡变化，同时采用细胞原位杂交法观察不同培养时间T淋巴细胞Bcl-2 mRNA及Bax mRNA表达变化。结果　正常组及哮喘组T淋巴细胞抗CD⁺₃单抗诱导后均出现凋亡典型形态改变, 哮喘患者外周血T细胞经抗CD⁺₃单抗诱导24小时后凋亡率为(9.19±2.25)%，48小时为（15.89±2.18）%，72小时为（21.37±3.24)%；与正常组24小时（17.9±2.22）%、48小时（25.25±3.53）%、72小时（35.14±2.53)%比较，差异有显著性(P均＜0.01)，哮喘组72小时方接近正常组24小时水平。哮喘组T淋巴细胞凋亡抑制基因Bcl-2 mRNA的表达各时相均与正常组比较，差异有显著性（P＜0.01）。而凋亡促进基因Bax mRNA表达则相反；哮喘组72小时Bcl-2/Bax 基因表达比率接近正常组24小时者。结论　哮喘发作时外周血 T淋巴细胞凋亡较正常组延迟，并与T淋巴细胞Bcl-2/Bax基因表达比率延迟相一致，提示T淋巴细胞凋亡率下降可能是哮喘患者气道慢性炎症持续存在的原因之一，而T淋巴细胞Bcl-2与Bax基因水平表达失衡可能是其分子调控机制之一。

Lymphocyte apoptosis in asthmatic patients and its molecular mechanism

XUE Jianmin, XU Yongjian, ZHANG Zhenxiang

Department of Respiratory Disease, Tongji Hospital, Tongji Medical Univerisity, Wuhan 430030

　　【Abstract】　Objective　To assess the apoptosis rate of peripheral blood lymphocytes isolated from patients with asthma and explore its molecular mechanism. Methods　Lymphocytes were isolated with ficoll- hypaque gradient method and T lymphocytes were further isolated with nylon pili. T lymphocytes were stimulated by anti- CD⁺₃ antibody for 0, 24, 48, 72 hours in vitro and the apoptosis rates were measured with in situ tailing technique. At the same time, Bcl-2 gene expression and Bax gene expression were observed with in situ hybridization. Results　The percentages of apoptosis cell in T lymphocytes from patients with asthma were significantly decreased and the timing delayed in comparison with those in normal controls (P＜0.01). The Bcl-2 mRNA expression in T lymphocytes was significantly increased in different time points than in normal controls (P＜0.01), but Bax mRNA expression in T lymphocytes was remarkably decreased (P＜0.01). The rates of Bcl- 2/Bax mRNA could not reach the state of the controls until 72 hours from the begining of the stimulation with the anti-CD⁺₃. Conclusions　The inhibited apoptosis might be one of the reasons for the chronic persistent inflammation in the airways in asthmatic patients and the imbalance between Bcl-2 gene expression and Bax gene expression may be one of the molecular mechanisms for the inhibited apoptosis.

　　【Key words】　Asthma　　T lymphocyte　　Apoptosis

　　哮喘是以嗜酸细胞、 淋巴细胞及肥大细胞浸润为主的气道慢性变态反应性炎症, 其中包括淋巴细胞活化及其细胞因子分泌增多，但原因是多方面的。晚近国内、外研究表明, 淋巴细胞凋亡与激活的调节失衡可能起重要作用^［1］。我们的试验通过对哮喘患者外周血T淋巴细胞Bcl-2及Bax mRNA表达及与T淋巴细胞凋亡的关系进行研究, 旨在探讨T淋巴细胞凋亡率在哮喘患者的变化规律及其分子调控机制。

　　对象与方法

　　一、对象

　　急性发作期哮喘患者12例（哮喘组），男、女各6例，平均年龄37岁，均符合1997年全国哮喘会议诊断标准^［2］, 受试者抽血前1周停用糖皮质激素。哮喘患者均为同济医院门诊患者。健康对照组10名, 男、女各5名，平均年龄35岁。均来自健康献血员。

　　二、探针及标记

　　Bcl-2、Bax cDNA探针均购自武汉博士德生物工程公司，根据试剂盒(德国Boehringermannheim)说明进行标记。

　　三、方法

　　1．外周血T淋巴细胞的分离：无菌取肘静脉血10 ml, 加等量Hanks液稀释, 用Ficoll淋巴细胞分离液分离, 用含10% 胎牛血清（Fbs）RPMI 1640培养液调至细胞浓度为5×10⁹/L, 于培养瓶中37℃贴壁培养2小时，进一步用无菌尼龙棉柱37℃作用30分钟，分离出T淋巴细胞，CD⁺₃间接碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（APAAP）法检测收集的T淋巴细胞纯度＞90%, 锥虫蓝拒染试验活细胞数＞90%。

　　2．外周血T淋巴细胞体外培养及抗CD⁺₃单抗诱导的细胞凋亡：用含10% Fbs RPMI 1640培养液调整T淋巴细胞浓度为5×10⁸/L，接种于24孔培养板内, 每孔1 ml，均加入终浓度为100 mg/L的抗CD⁺₃单抗(同济医大免疫室沈关心教授惠赠)，分别于5%CO₂、37℃培养箱内培养0、24、48、72小时，将培养的T淋巴细胞进行细胞原位杂交及原位末端（TUNEL）终止法检测凋亡。

1　抗CD⁺₃单抗诱导哮喘患者外周血T淋巴细胞72小时,Bax mRNA表达阳性细胞较正常者减少　原位杂交　　×200

2　抗CD⁺₃单抗诱导正常人外周血淋巴细胞72小时，Bax mRNA表达阳性细胞较哮喘患者明显增多　原位杂交　×200

3　抗CD⁺₃单抗诱导哮喘患者T淋巴细胞72小时，Bcl-2 mRNA表达阳性细胞较正常人增多　原位杂交　×400

　　3．Bcl-2及Bax mRNA的原位杂交：将上述培养的T 淋巴细胞涂片，干燥后用4%多聚甲醛固定30分钟，-70℃保存待测。原位杂交的步骤如下：涂片经HCl、蛋白酶K依次消化，甘氨酸、磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗, 37℃预杂交1小时［预杂交液含50%去离子甲酰胺, 10%硫酸葡聚糖，5×Derhardt（2%牛血清白蛋白，2%聚乙稀吡咯烷酮，2%水溶性聚蔗糖），5×SSC（3 mol/L NaCl，0.3 mol/L柠檬酸钠），10 mg/L变性鱼精脱氧核糖核酸（DNA）］。每张玻片加20μl杂交液，加硅化盖玻片，液体石蜡封片，95℃变性10分钟，-20℃骤冷5分钟，于42℃湿盒杂交36小时，无水乙醇浸泡，不同浓度SSC和十二烷基硫酸钠（SDS）漂洗。含牛血清白蛋白封闭液封闭30分钟。加地高辛抗体复合物37℃ 1小时。加平衡缓冲液新配制的底物液氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(NBT/BCIP)避光显色。常规透明、封片。以上所有溶液均以焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水配制。各组均设阴性对照玻片，免去探针, 免去地高辛抗体。于光学显微镜下计数1 000个细胞, 以表达Bcl-2或Bax mRNA阳性细胞的百分率表示结果。

　　4．原位末端终止法检测细胞凋亡：参照文献［3］方法，简述如下：玻片用4%多聚甲醛固定后，蛋白酶K(5 mg/L) 37℃作用30分钟，TDT反应液37℃孵育60分钟，加碱性磷酸酶(AP)抗DIG抗体, 37℃ 45分钟，滴加显色液(NBT及BCIP)适当避光显色后终止显色，甘油明胶封片。光学显微镜下观察，随机选择5个视野，计数1 000个细胞, 计算凋亡细胞百分率。

　　5．锥虫蓝拒染实验：取20 μl细胞悬液，加等体积2%锥虫蓝染液，混匀后在细胞计数板上计数，拒染细胞为活细胞(包括细胞膜仍完整的凋亡细胞和真正的活细胞)，蓝色细胞为死细胞。

　　6．电镜观察：T淋巴细胞沉淀用3%戊二醛固定，2%锇酸(pH7.4)后固定(4℃)，乙醇丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，制作超薄切片, 铀铅双重染色，透射电镜观察细胞形态。

　　7．统计学处理：数据以±s表示, 组间比较采用t检验法进行。两变量的相关程度用直线相关法分析。

　　结果

　　一、外周血T淋巴细胞(PBL)Bcl-2及Bax mRNA表达

　　可见胞浆内呈深紫蓝色染色者为杂交阳性细胞。正常组外周血T淋巴细胞经抗CD⁺₃单抗100 mg/L诱导后, 随培养时间的延长, Bax mRNA表达逐渐增多，72小时达高峰，而Bcl-2 mRNA表达则相反，72小时Bcl-2 mRNA表达到低限；哮喘患者PBL的 T淋巴细胞经抗CD⁺₃单抗诱导后, 24、48、72小时各时段的Bax mRNA表达均较正常组减少, 而Bcl-2 mRNA 均较正常组增多, 且哮喘组患者72小时Bcl-2/Bax基因表达比率接近于正常组24小时者。不同培养时间活细胞数均＞90%(表1，图1～4)。

4　抗CD⁺₃单抗诱导正常人T淋巴细胞72小时，Bcl-2 mRNA表达阳性细胞较哮喘患者减少　原位杂交　×400

　　二、TUNEL原位末端标记检测细胞凋亡

　　可见核染色深蓝色的为凋亡细胞。急性期哮喘患者PBL中T淋巴细胞在抗CD⁺₃单抗诱导发生凋亡率较同样培养条件和时间的正常组显著降低，差异有显著性（P均＜0.01），72小时者接近正常组24小时者(图5，6)。

图5　抗CD⁺₃单抗诱导哮喘患者T淋巴细胞72小时，凋亡细胞较正常者减少　TUNEL　×400

6　抗CD⁺₃单抗诱导正常人T淋巴细胞72小时，凋亡细胞较哮喘者增多　TUNEL　×400

表1　哮喘及正常组PBL T淋巴细胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达及不同培养时间凋亡发生率的比较(%，±s)

　　注：与正常组比较^*P＜0.01

　　三、细胞形态改变

　　电镜下观察可见未发生凋亡的T 淋巴细胞核染色质分布均匀，胞浆无改变(图7)。经抗CD⁺₃单抗诱导后出现许多凋亡细胞, 核染色质凝集成块状, 细胞膜仍完整(图8)。

　　四、外周血T淋巴细胞不同培养时间凋亡细胞阳性率与Bcl-2/Bax基因比率相关关系

　　哮喘组凋亡T淋巴细胞阳性率与24、48、72小时 Bcl-2/Bax基因表达比率均呈负相关(r=-0.59、-0.61、-0.65, P均＜0.05)。

图7　正常T淋巴细胞　透射电镜　×10000

8　凋亡T淋巴细胞　透射电镜　×10000

　　讨论

　　细胞凋亡是指由基因控制的细胞程序性死亡现象, 细胞凋亡过程的失衡与自身免疫性疾病及肿瘤等发病有关。目前哮喘发病中, 炎性细胞凋亡所起的作用日益受到重视, 但在炎症发生、持续及消散等过程中, T淋巴细胞凋亡及凋亡的分子调控机制，尤其是Bcl-2及Bax基因表达情况, 研究报道尚少见。探讨该问题有助于阐明哮喘气道炎症的发病机制。

　　外来抗原通过TCR/CD⁺₃途径不仅活化外周血成熟的 T淋巴细胞，同时大剂量抗CD⁺₃单抗可以诱导T淋巴细胞凋亡^［4］。本组试验结果显示，正常组及哮喘组患者外周血T淋巴细胞经大剂量抗CD⁺₃单抗诱导，可出现典型凋亡形态改变。发作期哮喘患者外周血T淋巴细胞经抗CD⁺₃单抗诱导后，随培养时间延长，凋亡T淋巴细胞逐渐增加，但不同培养时间凋亡T淋巴细胞阳性率均较正常组减少，72小时方接近正常组24小时者，显示凋亡改变明显延迟，并与Bcl-2/Bax基因表达比率的逐渐减低趋势相一致。淋巴细胞凋亡是免疫系统通过克隆清除维持自身免疫的重要机制之一。T淋巴细胞的凋亡也是对抗原增殖反应的反馈调节。Bcl-2基因及其蛋白主要通过阻断凋亡信息传递系统的最后通路抑制凋亡, 可延长细胞存活，而Bax为促凋亡基因，其产物可拮抗Bcl-2的作用^［5］，假定“Bcl-2/Bax基因对”构成细胞内的微调变阻器，Bcl-2/Bax基因比率决定细胞是接受或拒绝直接收到的死亡命令，若细胞内Bcl-2 mRNA表达占优势，它结合掉所有的Bax余下的Bcl-2相互结合成“Bcl-2-Bcl-2对”，由此细胞就得以生存；反之细胞则死亡^［6］。在发育过程中，当细胞需要凋亡予以清除时，Bcl-2/Bax基因比率相应降低。本组实验结果表明，急性发作期哮喘患者T淋巴细胞凋亡延迟, 并与Bcl-2/Bax基因表达比率失衡有关。该结果提示，T淋巴细胞凋亡率下降可能是哮喘患者气道慢性炎症持续存在的原因之一, 而T淋巴细胞Bcl-2与Bax基因水平表达失衡可能是其分子调控机制之一。本组研究结果对于全面阐明哮喘患者气道慢性炎症的发生和发展机制, 进而探讨针对性的防治措施，具有积极的意义。

　　参考文献

　　1　Spinozzi F, Fizzotti M, Agea E, et al. Defective expression of Fas messenger RNA and Fas receptor on pulmonary T cells from patients with asthma. Annal Intern Med, 1998,128:363-369.

　　2　中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南(支气管哮喘的定义、诊断、治疗、 疗效判断标准及教育和管理方案). 中华结核和呼吸杂志, 1997， 20: 261-267.

　　3　Nonclercq D, Reverse D, Toubeau G, et al. In situ demonstration of apoptotic germ cells in an experinental model of chemical castration.Biochemica, 1997,1:12-15.

　　4　Wesselborg S, Janssen D, Kabelitz D, et al. Induction of activation-drive death (apoptosis) in activated but not resting peripheral blood T cells. J Immunol, 1993, 150:4338-4345.

　　5　Craig RW. The Bcl-2 gene family. Semin Cancer Biol, 1995,6:35-41.

　　6　Red JC. Bcl-2 and the regulation of programmed cells death. J Cell Biol, 1994,124:1-6.

收稿：1998-11-12

　　修回：1999-02-08