幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A及细胞空泡毒素A的研究

世界华人消化杂志 1998年第2期第0卷 文献综述

作者：韩锋产　阎小君　苏成芝

单位：第四军医大学全军基因诊断技术研究所　陕西省西安市　710032

关键词：细菌蛋白质类/分析；螺杆菌，幽门；细胞毒素/分析

　　Subject headings　bacterial protein/analysis; Helicobacter pylori; cytotoxins/analysis

　　中国图书资料分类号　R378

　　幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)已被确定为慢性胃炎的一个重要的致病因子，同时又是消化性溃疡及胃癌发生的一个危险因素.在人群中约有一半的人受到Hp感染，不少人发展为慢性胃炎，然消化性溃疡及胃癌的发生毕竟为少数，这除了与人类的个体差异等因素有关外，还与Hp感染的类型有关，即某些菌株可产生细胞毒素.在Hp诸多的致病因素中，细胞毒素相关蛋白A(Cytotoxin associated gene A, Cag A)及细胞空泡毒素A(Vacuolating cytotoxin A, Vac A)倍受关注.

　　1　Cag A及Vac A的分子生物学特征

　　从基因水平分析，Hp菌株表现为高度的多样性^［1］，造成Hp的某些表型的不稳定性.其中有两点较为重要：一是约50%～60%的Hp菌株在体外产生Vac A；二是约60%～80%的Hp菌株表达120～128kDa的蛋白质(Cag a)^［2］.

　　1993年，Tummuru et al^［3］以λ zapⅡ为载体，利用Hp菌株(84～183)染色体的随机酶切(Eco. rⅠ)片段，建立一个容量为40 000的Hp基因文库，转化大肠杆菌XL₁-Blue后，用Hp感染者的血清进行免疫学筛选，从一个阳性克隆中得到了 P^MC3，为含cag A 5′-端大部的Bluescript质粒；与此同时，又从另一个λgtll文库的阳性克隆中得到了P^YB2，为含cag A 3′-端小部的P^UC19. 经重叠删除，获得了cag a的全基因，具有一个单一的开放阅读框架，全长3543bp，起始码为ATG，终止码为TAA，核糖体结合位点(SD)AGGAG在ATG上游6bp处，启动子的位置也已确定(-10或-35处). cag A以单拷贝存在于Hp中，它编码Mr 131.5kDa的Cag A，含1181个氨基酸.该蛋白质最明显的特征是具有3个区域的直接重复序列，氨基酸数分别为11，5及16，重复2次；另一特征是Cag a中赖氨酸及精氨酸含量较高，分别为11.9%及9.9%；再者Cag A与叶绿体H⁺转运ATP合成酶在1～482位氨基酸残基之间有16.8%的序列相同及50%的序列同源；与钠通道蛋白在123～1182位氨基酸残基之间有17.3%的序列相同和42.6%的序列同源. covacci et al^［4］报道的cag A序列与此序列略有区别，由于基因内某些区域出现了序列重复现象，cag a的大小在不同菌株有所不同. 例如，两株Hp-G39及CCUG1784的cag A结构在3406位以前完全相同，但在此位置后，G39菌株的cag a含有一个204bp的插入片段，由102bp的序列重复所形成.

　　Cag A是一种亲水性的细菌表面蛋白，具有高度的抗原性. cover^［2］ 曾在Hp细胞空泡毒素阳性菌株的培养上清液中分离到了Cag a(128kDa).其从菌体的释放可能是由蛋白酶作用的结果，该蛋白酶来自培养基中的小牛血清，在体内也可能存在类似的释放机制. cag A不含前导肽序列，以非分泌的方式转运^［4］.

　　1992年，Cover et al^［6］采用硫酸铵沉淀、疏水性交互层析、分子排阻层析及阴离子交换层析，从人胃粘膜Hp的培养上清液中纯化到了一个Mr87 000的均一的细胞空泡毒素(Vac A)，其氨基末端与多种转运蛋白或离子通道蛋白的内部序列有同源性，并公布了Vac a的氨基酸组成及氨基末端的氨基酸序列. Telford et al^［9］根据该蛋白氨基末端23个氨基酸序列，设计了两组简并寡核苷酸引物，一组含编码前6个氨基酸(AFFTTV)的各种可能密码，另一组与可编码后6个氨基酸(GTAVGT)的各种可能序列互补.然后以Hp菌株(CCUG1784)DNA为模板进行PCR扩增，得到一个预计大小的片段，对该产物再用随机引物进行PCR扩增中的³²P标记，进而对Hp dNA的HindⅢ酶切片段克隆入Bluescript质粒所构建的文库进行筛选，最终得到了含vac a全基因的2个克隆. vac A长3888bp，有一个长的开放读码框架，起始密码及终止码分别为AGT及TAA.起始密码前有启动子及SD序列(AGGA)等. 该基因编码Mr 139.7kDa的蛋白质，由1296个氨基酸组成，前33个氨基酸为信号肽，以分泌的方式排出菌体外，其活性形式为94kDa的蛋白质.在该蛋白中没有发现提示跨膜区的疏水结构.

　　Phadnis^［11］也利用Vac A的氨基酸末端序列，以类似的方法克隆确定了vac a全基因，其序列与Telford报道的相同. Hp菌株中均含单拷贝的vac a. 从vac A的邻近序列分析，vac A位于一个半胱氨酰tRNA合成酶基因之后，但不存在可与vac a一起转录的其他基因.当在该基因中插入卡那霉素抗性标志，便产生了一个细胞空泡毒性缺失的等位突变基因，这也充分证明vac a编码了细胞空泡毒素. vac A的长度亦有变异，其编码区也具有一系列的直接重复序列，多数重复序列可以在同一读框内翻译，产生氨基酸序列的重复.有些Hp菌株细胞空泡毒素阴性而vac A阳性(M019)，是否会因为这种重复序列的改变影响了Vac a的表达或其表达后的功能，有待进一步研究.

　　2　Cag A与Vac A的生物学作用

　　关于Cag A确切的生物学功能目前还不清楚. Covacci et al^［4，6］曾通过凝胶柱层析法从Hp培养上清液中纯化得到两种分子量的蛋白质，其中128kDa的蛋白质(Cag a)缺乏细胞空泡毒性，87kDa的蛋白(Vac A)具有使细胞空泡样变的性质.并认为细胞空泡毒性是由Vac A所致，Cag A则可能与Vac A的折叠、运转及其功能有关.进一步的研究表明，cag A与vac A在染色体水平相隔300kb，cag A的人为突变不会影响Hp细胞空泡毒素的活性，而vac a的突变将使细胞空泡毒性消失，故也有学者认为cag A可能仅仅是Hp其他遗传要素的一个标志，这些要素影响到细胞空泡毒素的表达；或cag a的出现是细胞空泡毒素阴性菌株的vac A序列转向多样化的一个标志^{［10，12，13］}.

　　为明确Cag A及Vac A共同表达的关系，Xiang et al^［13］对43种临床分离Hp菌株的基因及其表型进行分析，以此为基础将所有的Hp菌株分为两大类：第一类，具有编码Cag a的基因，能产生Cag A及Vac A. 第二类，不具有编码Cag A的基因，不产生Cag a及Vac A. 但在第一类中又有许多中间型：(a)具有编码Cag A的基因，产生Cag A，不产生Vac A；(b)具有编码Cag A的基因，不产生Cag A，却产生Vac A；(c)具有编码Cag A的基因，但既不产生Cag A，又不产生Vac a；(d)不具有编码Cag A的基因，但产生Vac A.这些结果充分表明，尽管Cag A存在于许多细胞空泡毒素阳性的Hp中，但其不是Vac a表达的必需因素.

　　对Vac A的生物学功能目前研究的比较清楚，它能致许多哺乳动物细胞的广泛性空泡样变.在感染了Hp的慢性活动性胃炎者的胃粘膜上皮也观察到了类似的结果^［20］，提示Hp的Vac a在慢性胃炎的病理改变中起重要作用^［2］.在体外，细胞的空泡样变可以被Ⅴ型ATPase的抑制剂所阻断或逆转，或被Na⁺-K⁺ATPase抑制剂所增强，提示细胞空泡毒素的作用机制是使靶细胞内阳离子运转发生异常^［7，8］.

　　Telford et al^［9］建立了这样一个动物模型，他们给小鼠口服纯化的94kDa的Vac a蛋白，能引起小鼠发生胃粘膜损伤，这种改变与人类疾患的病理改变类似.同时又表明，Vac A的毒性作用是直接性损伤，而非间接的炎性机制所引起，因为在粘膜固有层几乎看不到炎性细胞浸润.但Zhang et al^［17］在体外的研究表明，细胞空泡毒素能诱导多形中性核细胞的暴发氧化(oxidative burst)，提示自由基的损伤也可能在Vac A阳性Hp的致病中起作用.

　　3　Cag A及Vac A与胃及十二指肠疾病

　　3.1　Cag A及Vac A与胃炎及消化性溃疡　Cag A有高度抗原性，Cag A阳性Hp菌株感染者血清有高滴度的抗-Cag a抗体存在. Covacci et al^［4］曾用ELISA法检测了患者对Cag a重组片段的免疫反应，发现75.3%的胃及十二指肠病患者(89例)血清抗体阳性，100%(20例)的十二指肠溃疡者血清抗体阳性. lage et al^［14］报道，91.7%的十二指肠溃疡者受到Cag A阳性Hp菌株的感染，慢性胃炎者Cag a阳性菌株的感染率为73%. Ching et al^［5］也报道，抗-Cag a抗体在 84%的十二指肠溃疡及80%的胃溃疡者阳性，显著高于功能性消化不良或无症状对照者，他们认为抗-Cag a抗体阳性可以作为消化性溃疡的一项临床指标看待.这些资料表明，Cag A与消化性溃疡及胃炎有密切关系.另外，在细胞空泡毒素阳性Hp感染者血清中往往可以检测到抗Vac a的中和性抗体；也有给小鼠口服Vac A导致胃溃疡的报道^［9］.

　　3.2　Cag A及VacA与胃癌　Crabtree et al^［15］曾报道多数胃癌患者血清中有高滴度的抗-Cag a抗体. Blaser et al^［16］ 选择了两组配对Hp感染人群，每组103例，其中一组是在21a内发展为胃癌的，另一组在此期间则均未发展为胃癌.通过ELISA法对两组血清中抗-Cag A IgG的检测，发现产生Cag A的Hp的感染增加了发展为胃癌尤其是胃远端的肠型胃癌的危险性. queiroz et al^［18］发现细胞空泡毒素阳性Hp在胃癌的感染率为65%；含cag a的Hp在胃癌的感染率达95%，从而第一次证实胃癌组织Hp分离株具有cag a，同时也指出Cag A可能是胃癌发生的一个重要因素，其作用机制尚不清楚. moss et al^［19］证实Hp能在体内诱导胃粘膜上皮细胞的凋亡，这一诱导因子很可能就是Cag a或Vac A. 细胞凋亡的加速会导致细胞的代偿性增生，这在慢性Hp感染者可能是一个潜在的癌前反应.

　　通讯作者　韩锋产收稿日期　1997-10-10

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