日本血吸虫表面膜抗原23kDa的亚克隆鉴定及表达

中国人兽共患病杂志 1999年第3期第15卷 论　　著

作者：李柳哲　石佑恩

单位：同济医科大学寄生虫学教研室（武汉，430030）

　　关键词： 日本血吸虫；23kDa；亚克隆；表达

　　摘　要　在已克隆的质粒pBluescript-Sj23基础上，设计二条引物。小量提取质粒pBluescript-Sj23进行PCR扩增，经扩增的Sj23亚克隆于真核表达载体pCD中，重组质粒转化E.coli TG₁。大量提取质粒pCD-Sj23，以剂量100μg/只给昆明小白鼠定位肌肉注射质粒pCD-Sj23，共注射2次，间隔时间为9天，每次注射前一天用0.5%盐酸布比卡因50μl/只预处理，第14天拉颈处死小鼠，定位处肌肉作冰冻切片，荧光标记抗体检测pCD-Sj23，见肌细胞胞浆及胞膜上有其抗原表达。

THE SUBCLONING, VERIFICATION AND EXPRESSION OF

　　SCHISTOSOMA JAPONICUM 23KDA GENE

Li Liuzhe　Shi Youen

　　(Department of Parasitology,Tongji Medical University Hubei,430030)

　　ABSTRACT　According to the published gene sequence of the Sj23, a pair of primers were designed.With the two primers,Sj23 isolated from E.coli TG₁ was amplified and subcloned into eukaryocyte expression vector.Recombinant plasmid were injected into muscle of mice,each of them was injected twice at the same point at a 9 days interval.The mice were sacrificed on the fourteenth day.Using the technology of histochemistry.A Ag-Ab reaction were observed in the frozen muscular tissue slice,the result indicated that the antigen could be expressed on the membrane of muscular cells.

　　KEY WORDS　Schistosoma japonicum 23kDa　Subcloning Expression

　　DNA疫苗具有亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导全面免疫反应的高效性^〔1～3〕。因此裸露DNA技术一经建立，即引起各学者的兴趣。但它问世毕竟不过几年，还有许多问题有待解决，也有许多方法尚待摸索与建立，如并非所有真核表达载体都适于DNA疫苗等。所以本实验将Sj23亚克隆于真核表达载体PCD中，观察其表达情况。

　　1 材料和方法

　　1.1　动物、菌种、质粒和阳性血清　5周龄雄性昆明小鼠由同济医大动物实验中心提供，含质粒PBluescript-Sj23、菌种E.coli TG₁、真核表达载体PCD由本室保存，感染日本血吸虫的小鼠阳性血清由本室提供。

　　1.2　化学试剂与酶类　限制性核酸内切酶XbaI,BamHI,T₄DNA连接酶、TaqDNA聚合酶均购自华美公司，羊抗鼠荧光抗体购自武汉生物制品研究所，其它试剂均为分析纯产品。

　　1.3　PCR引物设计与合成　根据Sj23基因序列设计2条引物：

上海生工生物公司合成

　　1.4　质粒pBluescript-Sj23和PCD的小量制备　参照文献^〔4〕，取含载体质粒pBluescript-Sj23和PCD的E.coli TG₁于LB中振荡，离心。菌液中依次加入100μl solutionⅠ(500mmol/L Glucose,25mmol/L Tris^．Cl,pH8.0,10mmol/L EDTA)。200μl solutionⅡ(0.2mol/L NaOH,1%SDS),150μl solutionⅢ(3mol/L KaAc pH5.2)充分混匀，再加入等体积tris饱和酚，氯仿-异戊醇（24∶1）依次抽提，水相用2倍体积无水乙醇沉淀DNA，75％冷乙醇洗涤，自然干燥后溶于适量TE(10mmol/L Tris*Cl,1mmol/L EDTA pH8.0)中。

　　1.5　PCR扩增质粒pBluescript-Sj23中23kDa基因片段　PCR反应体系50μl含质粒pBluescript-Sj23约0.5μg,50pmol/L primer上和primer下各1μl,10mM dNTP混和物1μl,10×PCR缓冲液5μl,25mM MgCl₂ 3μ TaqDNA聚合酶1μl,加矿物油约40μl，离心混匀，置PCR仪上，95℃变性5min，以94℃变性45sec，52℃复性1min，72℃延伸2min，循环35次，最后72℃10min终止反应，参考文献^〔4〕。

　　1.6　重组质粒的构建及鉴定

　　1.6.1　PCR产物和PCD的酶切、连接　用BamHI和XbaI对PCR产物及PCD分别进行双酶切，参考文献^〔4〕，酶切反应体系于37℃保温过夜，电泳回收，以1∶4摩尔比混合酶切后的载体及目的基因片段，加连接缓冲液(50mmol/L Tris^．Cl pH7.4,10mmol/L MgCl₂,20mmol/L DTT,1mmol/L ATP),并加入T₄DNA连接酶，12～16℃保温20h。

　　1.6.2　转化及筛选、鉴定　冷CaCl₂法^〔4〕制备新鲜的TG₁感受态细菌，部分DNA连接液加入200μl受体菌，冰浴1h，置42℃2min，加入约1ml LB培养液，37℃振荡1h后，均匀涂布于LB(AMP⁺)平板上，吸收后倒置培养过夜（设对照），次日挑数个阳性白色菌落，快速质粒提取，分别进行酶切分析及PCR扩增鉴定。

　　1.7　质粒PCD-Sj23大量制备　50ml含PCD-Sj23的E.coli TG₁菌，5000r/min离心，倾去上清，重复上述过程，菌体中依次加入2ml solutionⅠ,4ml solutionⅡ,3ml solutionⅢ,充分混匀，离心15min(4℃），上清用0.6倍体积异丙醇摇匀，静置2h，同速离心15min。沉淀溶于50μl TE中，等体积LiCl混匀，移PE管，静置10min，以1200r/mi×10min,上清等体积异丙醇沉淀10min,12000r/min×10min,加入RNaSeA,37℃消化5min（浓度为100μg/ml),依次用TE饱和酚，氯仿—异戌醇（24∶1）抽提，1/10体积3μ NaAc，2.5倍体积无水乙醇沉淀2h,离心去上清，70％乙醇洗涤，干燥后溶于适量生理盐水，测定OD值。浓度调至1μg/ml，方法参考^〔4〕略有不同。

　　1.8　定位免疫小鼠

　　5周龄雄性昆明小鼠，清去大腿外侧毛，苦味酸定点标记，于第一、第十天定点注射100μg/只的质粒DNA(PCD-Sj23),注射前一天同一位置用0.5%盐酸布比卡因50μl预处理，注射用质粒DNA需用生活盐水调至浓度1μg/μl。

　　1.9　荧光标记抗体检测抗原表达

　　免疫小鼠于第14天拉颈处死，取定点处肌肉，冰冻切片6～7μm，丙酮固定5min，PBS洗涤3次，加1∶10小鼠阳性血清37℃，孵育1h后4℃过夜，PBS洗后，加入1∶10羊抗鼠荧光抗体，37℃1h后，PBS洗涤，蒸馏水浸泡2分钟，冷风吹干后，荧光显微镜下观察。

　　2　结果

　　2.1　23kDa基因的扩增　取5μl的PCR反应产物在2％琼脂糖凝胶上电泳（含0.5μg/μl的EB)，结果可见一条清晰的扩增条带，扩增片段与23kDa基因片段大小一致，未见非特异性扩增带，见图1。

图1　PCR产物的2％琼脂糖凝胶电泳

　　1.PCR Mark 2.标准Sj23　3,4.PCR扩增的Sj23基因

　　2.2　23kDa基因克隆的筛选及鉴定

　　2.2.1　PCR扩增鉴定　取阳性克隆的数个重组质粒进行PCR反应，取反应产物凝胶电泳，显示出一条特异性的DNA条带，与标准Sj23分子量一致，未见非特异性条带，见图2。

图2　亚克隆后重组质粒的PCR产物电泳分析

　　1.Sj23分子量标准　2,3.含Sj23重组质粒的PCR产物　4.PCR Marker

　　2.2.2　酶切鉴定及电泳分析　取经过PCR扩增鉴定的数个重组质粒PCD-Sj23单酶切及双酶切，酶切产物电泳，双酶切的两个片段分别与载体对照及PCR产物对照条带相符，而单酶切片段则由于载体中增加23kDa片段，故落后于PCD空载体对照。结果见图3。

　　2.3　表达抗原的鉴定　免疫组化反应片，置于荧光显微镜下观察可见某些肌细胞横切面组织中胞膜及胞浆出现强荧光，而周围肌细胞则未见荧光，阴性对照组未出现特异性荧光。表明有强荧光出现的肌细胞为特异性表达Sj23抗原的细胞。

图3　重组质粒PCD-Sj23的BamHI/XbaI酶切分析

　　1.λDNA/HindⅢ分子量标准　2.PCD空载(BamHI单切）　3.Sj23分子量标准　4.PCD空载（XbaI单切）　5.PCD-Sj23单酶切(BamHI)　6.PCD-Sj23双酶切

　　3　讨论

　　利用已克隆的Sj23，从保存菌种中快速小量提取质粒pBluescript-Sj23后，无需进行酶切，即可方便地利用所设计引物进行PCR扩增，得到所需目的基因片段，由于所设计引物含有特异性酶切位点并且包含启动子和终止子，因此可定向装载入表达载体中，并且扩增出完整的目的基因片段，特异性引物包含两个酶切位点，为其快速鉴定提供了可靠依据。

　　DNA疫苗由于其独到的优点，如:可直接将编码某种蛋白的外源基因DNA注入宿主体内使其在体细胞内转录和表达;因其在体内可持续产生刺激抗体免疫系统而且具有减毒活疫苗相似的功能，因而作为一种新型的基因免疫方式它受到广大学者的重视。本实验将Sj23装载于真核表达载体PCD中，其裸露DNA(PCD-Sj23)可以通过肌细胞吸收，在肌细胞内转录，并且表达于肌细胞胞浆及胞膜上，说明真核表达载体PCD-Sj23可以在体内表达并作为抗原免疫动物，这为其后续的Sj23 DNA疫苗的进一步研究提供了基础与前提。

　　4　参考文献

　　1.Wolff JA,et al.Long term persistence of plasmid DNA and foreign gene expression in mouse muscle.Hum Mol Genet,1992,1:363.

　　2.Wolff JA,et al.Conditions affecting direct gene transfer into rodent muscle in vivo.Biotechniques,1991,11:474.

　　3.Xiang ZQ,et al.Vaccination with a plasmid vector carrying the rabies virus glycoprotein gene induces protective immunity against rabies virus.Virology,1994,199:132.

　　4.Sambrook J,et al.Molecular cloning second eds,cold spring Harbour,NY 1989.

收稿日期：1997年11月4日　修回日期：1998年12月27日