γ-干扰素基因修饰肝细胞治疗血吸虫病肝纤维化实验研究

中华传染病杂志 1999年第3期第17卷 论著

作者：张立煌　姚航平　曹雪涛　于益芝　陈洪　李敏伟

单位：张立煌、姚航平、陈洪、李敏伟　310006　杭州，浙江大学附属第一医院传染病研究所；曹雪涛、于益芝　第二军医大学免疫教研室

关键词：γ-干扰素；基因治疗；血吸虫病；肝硬化

　　【摘要】　目的　探讨γ-干扰素(IFN-γ)基因修饰的肝细胞经脾移植抗血吸虫病肝纤维化作用。方法　采用ELISA和免疫组化方法，动态分析日本血吸虫感染小鼠IFN-γ和Ⅰ、Ⅲ型胶原水平及其相互关系，并将小鼠IFN-γ重组腺病毒转染的肝细胞经脾移植到感染16周小鼠，分析IFN-γ基因治疗血吸虫病肝纤维化的作用。结果　感染4周时，小鼠IFN-γ水平明显升高，在感染12周时达高峰；但在16周以后IFN-γ水平明显下降，而Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成持续增高；IFN-γ基因修饰的肝细胞经脾移植后能稳定有效地表达，显著降低Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成、沉积，减轻肝纤维化程度。结论　IFN-γ可能与Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成、沉积有关；IFN-γ基因治疗能有效地发挥抗血吸虫病肝纤维化作用。

Study on the efficacy of IFN-γ gene-modified murine hepatocytes against hepatic fibrosis in Schistosomiasis japonica

ZHANG Lihuang,YAO Hangping,CAO Xuetao,et al.

　　The first Affiliated Hospital,Zhejiang University,Hangzhou 310003

　　【Abstract】　Objective　To investigate the efficacy of γ-interferon (IFN-γ) gene-modified hepatocytes against hepatic fibrosis by intrasplenic transplantion.Methods　Levels of INF-γ as well as type Ⅰ and Ⅲ collagen in the mice infected by S.japonicum were dynamically analysed by ELISA and immunohistochemical assay.At the 16th week,the infected mice were intrasplenic transplanted with murine hepatocytes transfected with INF-γ gene-combinant adenovirus.Results　At the 4th week of post-infection,murine INF-γ leve was increased markedly and reached to a peak at the 12th week,but decreased dramatically after the 16th week of post-infection,while the levels of type Ⅰ and Ⅲ collagen were increased continuously.Meanwhile,the intrasplenic transplanted IFN-γ gene-modified hepatocytes steadily expressed IFN-γ and obviously reduced the synthesis and deposition of type Ⅰ and Ⅲ collagen as well as the severity of hepatic fibrosis.Conclusion　IFN-γ may play an important role in decreasing the production and deposition of type Ⅰ and Ⅲ collagen,while IFN-γ gene transplantation can inhibit hepatic fibrosis in Schistosomiasis japonica effectively.

　　【Key words】　γ-Interferon　　Gene-therapy　　Schistosomiasis　　Liver cirrhosis

　　γ-干扰素(IFN-γ)是目前已知有确切抗肝纤维化作用的细胞因子。实验表明能明显抑制感染血吸虫小鼠贮脂细胞激活，减少胶原的合成^［1］。晚期血吸虫病患者通常都有免疫功能低下，其血清IFN-γ水平明显低于正常人。动物实验和临床应用IFN-γ治疗血吸虫病肝纤维化和肝炎后肝纤维化均取得明显的效果^［2］。但体内影响IFN-γ药效因素很多，如半衰期短、抗体的产生，与靶器官以外的器官、组织、细胞受体结合，大剂量应用有明显的毒副作用等。实验表明，脾内移植肝细胞能定向分布于肝脏，并同化入肝实质中存活，有效地表达外源基因^［3］，我们在分析血吸虫感染小鼠IFN-γ动态变化及其与胶原合成关系的基础上，将IFN-γ基因修饰的肝细胞经脾移植，探讨抗血吸虫病肝纤维化的作用。

　　材料与方法

　　一、实验材料

　　BALB/c小鼠，6～8周龄，雄性，购自上海必凯实验动物公司；小鼠正常胚胎肝细胞株BNL·CL2细胞购自美国ATCC；表达小鼠IFN-γ基因的重组腺病毒Ad-ex1 CA-mIFN(IFN-γ/Ad)，表达LacZ基因的重组腺病毒Ad-ex1 CA-RXZ(LacZ/Ad)由日本癌症研究会分子生物治疗研究部Hamada博士惠赠；mIFN-γ ELISA检测试剂盒，抗小鼠IFN-γ、Ⅰ、Ⅲ型胶原单抗均购自Endogen公司；SABC试剂盒购自武汉博士德公司。

　　二、血吸虫病肝纤维化模型

　　80只BALB/c小鼠随机分为正常对照、感染和治疗组。除正常对照外，其余皮下感染日本血吸虫尾蚴25条。感染组分别在感染后4、8、12、16、20、24周解剖；治疗组在感染16周作肝细胞脾内移植。取各实验组部分肝组织用10%福尔马林固定，制成4μm厚石蜡切片，作免疫组化；同时取血清，-20℃保存，待检。

　　三、肝细胞体外基因修饰

　　取对数生长期BNL·CL2细胞，经Hanks液洗2遍后，用无血清RPMI-1640调至1×10⁶/ml，加至24孔板中，每孔1ml，待细胞贴壁后弃上清，按重复感染度(MOI)为1∶100加入病毒稀释液0.5ml，37℃5%CO₂温箱中温育30分钟，洗去残留病毒液，补充RPMI-1640 1ml，37℃5%CO₂温箱中温育，每隔4小时收集培养上清，-20℃保存待检。

　　四、肝细胞脾内移植

　　治疗组在感染后16周作肝细胞脾内移植。收集对数生长期的肝细胞，经Hanks液洗2遍后配成1×10⁷/ml备用。乙醚麻醉小鼠，局部消毒后，于左肋下做1cm左右切口，暴露脾脏，脾内注射肝细胞0.2ml(2×10⁶细胞/只)，设BNL·IFN-γ治疗组、BNL·LacZ病毒对照组、BNL·CL2细胞对照组三个亚组，在移植后第4、8周解剖。

　　五、培养上清和血清IFN-γ水平检测

　　按Endogen公司产品说明书，用ELISA法检测培养上清和血清中的IFN-γ水平。

　　六、肝组织内IFN-γ、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的检测

　　采用SABC法，一抗为抗小鼠IFN-γ、Ⅰ、Ⅲ型胶原单抗，二抗为生物素化羊抗鼠IgG，继用SABC复合物，DAB显色，脱水、透明、封片后，用图像分析仪MIPS作阳性分布面积半定量分析。

　　七、统计学处理

　　组间均数比较采用双侧t检验。

　　结　　果

　　一、重组腺病毒转染BNL·CL2细胞培养上清IFN-γ水平检测

　　mIFN-γ重组腺病毒转染4小时即可在培养上清检测到IFN-γ(5.64±2.16)ng/ml，24小时时达高峰(60.54±16.42)ng/ml，而转染LacZ基因的病毒对照和未转染的细胞对照未检测到IFN-γ。转染后14天，培养上清中仍可检测到IFN-γ(36.22±8.64)ng/ml，说明mIFN-γ重组腺病毒能有效地转染IFN-γ基因到肝细胞稳定表达。

　　二、感染小鼠血清IFN-γ的动态变化

　　正常小鼠血清IFN-γ含量仅(2.94±0.96)ng/ml，感染4周时血清中可检测到较高水平的IFN-γ(15.62±3.00)ng/ml，8周时为(21.66±3.72)ng/ml，12周时达高峰(28.92±3.86)ng/ml，随后明显下降，感染16周时降至(17.84±2.41)ng/ml，20周时为(14.32±2.73)ng/ml，24周时为(7.52±2.73)ng/ml。正常对照、感染后4、12、16、24周组间比较差异均有显著性(P＜0.01)。

　　三、感染小鼠肝内IFN-γ、Ⅰ、Ⅲ型胶原的动态变化

　　正常小鼠肝内IFN-γ散在分布肝窦壁附近，量稀少。感染4周时虫卵肉芽肿开始形成伴炎症反应，IFN-γ表达开始增加，随虫卵肉芽肿炎症加重，IFN-γ含量也明显增多，感染12周时达高峰，明显多于感染后4、8周时水平(P＜0.01)，主要分布在虫卵肉芽肿周围和肝窦壁。感染后16周虫卵肉芽肿成熟，炎症减轻，IFN-γ表达明显减少，与12周时相比差异也有显著性(P＜0.01)。同时可见，随着感染时间的延长，Ⅰ、Ⅲ型胶原含量逐渐增多，并由感染初期的细线状逐渐增厚变宽，呈条索状或网状分布在虫卵肉芽肿和汇管区周围。见表1。

表1　感染血吸虫小鼠肝内IFN-γ、Ⅰ、Ⅲ型胶原

　　的动态变化(阳性面积百分比)

注：▲ 指与正常比较P＜0.01，▲▲ 指与感染后8周比较P＜0.01，* 指与感染后12周比较P＜0.01

　　四、肝细胞移植后血清IFN-γ水平

　　移植后第4周，BNL·IFN-γ治疗组血清可见高水平的IFN-γ(81.54±11.19)ng/ml，与移植BNL·LacZ基因的病毒对照组(28.62±6.15)ng/ml和BNL·CL2细胞对照组(20.30±4.61)ng/ml比较差异有显著性(P＜0.01)；并且在移植后第8周，BNL·IFN-γ治疗组仍可测到高水平的IFN-γ(70.42±14.67)ng/ml，与移植后第4周时相比差异无显著性(P＞0.05)。可见，移植后第8周仍有高效表达。

　　五、肝细胞移植后对肝内胶原合成的影响

　　移植后第4周，BNL·IFN-γ治疗组肝内可见许多散在集落状IFN-γ着色阳性细胞，虫卵肉芽肿周围也有明显的IFN-γ表达，与同期单纯感染组、病毒对照组、细胞对照组相比，差异均有显著性(P＜0.01)。同时可见，BNL·IFN-γ组肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显减少，与同期感染组、病毒对照组和细胞对照组比较差异均有显著性(P＜0.01)；而感染组、细胞对照组和病毒对照组组间比较差异无显著性(P＞0.05)。见图1。

1　肝细胞移植后对肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原的影响

　　讨　　论

　　血吸虫病肝纤维化主要与虫卵肉芽肿及其某些细胞因子有关，其中IFN-γ既影响虫卵肉芽肿的形成，又抑制贮脂细胞的激活，减少胶原的合成^［1，2］。本研究结果表明感染早期随着虫卵肉芽肿形成和炎症反应加重，血清和肝内IFN-γ水平均显著增加，这可能与较多的淋巴细胞浸润并释放IFN-γ有关。而在虫卵肉芽肿成熟，炎症反应减轻时，血清及肝内IFN-γ水平均明显减低。提示在感染早期IFN-γ作为炎症因子与虫卵肉芽肿形成有关，而在后期与胶原纤维的合成沉积相关。

　　根据感染过程IFN-γ与Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的关系，我们在感染后16周，即虫卵肉芽肿成熟，IFN-γ水平降低，而Ⅰ、Ⅲ型胶原表达明显增加时，将IFN-γ基因修饰的肝细胞经脾移植，分析其抗血吸虫病肝纤维化作用。结果表明，移植后第4周，BNL·IFN-γ治疗组血清和肝内IFN-γ表达水平均有显著增高，与同期(感染20周)的感染组、病毒对照组和细胞对照组比较，差异均有显著性，网状结构消失，纤维条索变细减弱。移植后第8周，BNL·IFN-γ治疗组仍有IFN-γ的高效表达，肝纤维化程度进一步减轻，可见有明显的抗肝纤维化作用。至于IFN-γ是如何发挥抗肝纤维化作用，除直接抑制贮脂细胞激活、增殖、合成细胞外基质外^［1，4］，可能是通过抑制其它细胞因子而影响肝脏细胞外基质的沉积^［5］，值得进一步研究。

　　肝脏靶向性基因治疗是目前基因治疗的研究热点之一，曹雪涛等^［6］将白细胞介素-2基因修饰的肝细胞脾内移植到荷瘤小鼠，能明显增强小鼠肝脏抗肿瘤免疫功能。本研究结果表明，将IFN-γ基因修饰的肝细胞脾内移植后，即移行到靶器官肝脏，稳定地表达IFN-γ，抑制肝内胶原的合成，从而达到抗肝纤维化作用。为基因治疗血吸虫病肝纤维化作了积极的探索，并为重型肝炎、肝癌及遗传性肝病的基因治疗提供了理论依据。

　　本课题受国家自然科学基金重点项目(编号：39730470)及国家杰出青年科学基金(编号：39825123)资助

　　参考文献

　　1　Czaja MJ,Weiner FR,Takahashi S,et al.γ-interferon treatment inhibits collagen deposition in murine schistosomiasis.Hepatology,1989,10:795-800.

　　2　贺永文，刘薇，曾令兰，等.γ干扰素对血吸虫病小鼠肝纤维化的影响.中华医学杂志，1996，76：371-374.

　　3　ZHANG W,CAO X,HUANG X,et al.In vivo distribution and gene exprission of genetically modified hepatocytes after intrasplenic transplantation.Science in China,1997，40:554-560.

　　4　Braoni GS,Ambrosio LD,Curto P,et al.Interferon gamma decreases hepatic stellate cell activation and extracellular matrix deposition in rat liver fibrosis.Hepatology,1996,23:1189-1199.

　　5　Lukacs NW,Boros DL.Lymphokine regulation of granuloma formation in murine schistosomiasis mansoni.Clin Immunol Immunopathol,1993,68:57-63.

　　6　曹雪涛，章卫平，王建莉，等.白细胞介素-2基因修饰的肝细胞脾内移植增强肝脏抗肿瘤免疫功能.中华医学杂志，1996，76：646-649.

(收稿：1998-11-03　修回：1999-01-30)