犬用口服狂犬病减毒活疫苗安全实验研究

中国人兽共患病杂志 1999年第6期第15卷 实验研究

作者：唐学慧　安大华　李鲁宁　吕　健　王育尧　 刘　森　张汉民

单位：唐学慧 李鲁宁 吕健 王育尧 张汉民淄博市卫生防疫站（淄博，255026）；安大华 湖滨乡卫生防疫妇幼保健站；刘森淄 博市工程咨询院

　　关键词： 狂犬病；口服减毒活疫苗；动物感染

　　摘要　目的　探讨犬用口服狂犬病减毒活疫苗(CTN-22毒株）的安全性 。

　　方法　依照WHO专家会议关于犬和野生食肉动物口服狂犬病疫苗接种现场试验要求和标准的报告；以及美国动物与动物制品法规—兽医生物制品标准，进行本疫苗的安全性试验。

　　结果　口服免疫的5只猫和口服、注射免疫的各5只黄毛鼠，观察21天，无任何症状发生，均健康存活；用本疫苗10个现场使用量的1ml，各对5只家犬肌肉和大隐神经及其周围组织浸润注射后，观察3～35天，无狂犬病症状，并按方法中所规定时间淘汰犬，剖取颈淋巴结、脑、唾液腺等组织分离病毒，均为阴性；3月龄10只犬以10个现场剂量口服免疫后，1、2、3天连续3次取唾液进行病毒分离亦均阴性，免疫后 观察6个月未显示狂犬病任何征象，均健康存活。

　　结论　证实CTN-22毒株制备的犬用口服狂犬病减毒活疫苗是安全的。

EXPERIMENTAL STUDIES ON SAFETY OF ORAL LIVE

　　ATTENUATED RABIES VACCINE FOR DOGS

Tang Xuehui An Dahua Li Luning et al(Zibo Municipal Anti-epidemic Station,Zibo 255026)

　　ABSTRACT Aim　To assure the safety of oral live attenuated r abies vaccine for dogs(CTN-22 strain).

　　Methods　 We did experiments ac croding to standards of dogs' and wild animals' oral immunization of rabies,whic h was written by WHO export and standards of biologic product for veterinarian.

　　Results　Five cats and five rattus losea were immunized o rally and five rattus losea by injection,all should healthily in 21 days.After giving infiltrated injection to five dogs' muscles and saphenous nerv e with 10 doses,no symptom of rabies was found from the third day to thirty-fift h day no virus was isolated from dog's neck lymphatic,brain and saliva gland tissues at different times .After oral immunization of 10 3-month-old dogs with 10 doses,no virus was att aind from dogs' saliva at first,second and third days.They all lived healthily i n six months.

　　Conclustion Oral live attenuated rabies vaccine for do gs made by CTN-22 strain for dogs immuningation is safe.

　　KEY WORDS Oral live attenuated rabies vaccine for dogs Animal infection Virus isolation Rabies

　　口服免疫犬是WHO狂犬病专题委员会建议推广的方法，其优点为简便、易行、群众易接受，可提高家犬的免疫率。国内应用CTN-22毒株制备的口服狂犬病减毒活疫苗，分别在广西、山东的现场实验，取得了令人满意的结果^［1，2］。为进一步证实本疫苗的安全性，依据农业部药典办公室推荐的有关标准与法规，进行了此安全试验，现将结果报告如 下。

　　1　材料和方法

　　1.1　依照“WHO专家会议关于犬和野生食肉动物口服狂犬病疫苗接种现场试验要求和标准的报告（1989年）”^［3］的规定进行实验。

　　1.1.1　疫苗按制造及检验规程，取CTN-22毒株，接种于11～12g小白鼠脑内制成5％犬用口服狂犬病减毒活疫苗。疫苗毒力LD₅₀＞10^5.5/0.03ml。

　　1.1.2　实验动物

　　1.1.2.1　选择3～6个月龄的健康幼犬10只（未进行狂犬病疫苗接种）。

　　1.1.2.2　用捕鼠笼捕获野鼠10只。

　　1.1.2.3　家养猫5只。

　　1.1.3　方法

　　1.1.3.1　取被试验的犬10只，将本疫苗(MIC LD₅₀＞10^5.5 /0.03ml）现场用量5％悬液(4ml)的10倍浓度量即40ml（50％悬液4ml）。给犬口服接种后，在第1、2和3天用棉拭子取唾液置于2ml2%小牛血清蒸馏水中，保存于-40℃冰箱内供病毒分离。

　　在免疫后6个月如有发病的犬则杀死，取脑和唾液腺依常规方法用乳鼠进行病毒分离。

　　1.1.3.2　取野鼠10只。分为两组，每组5只，用本疫苗的现场使用量0.05ml分别口服和肌肉注射，专人饲养，观察21天。

　　1.1.3.3　取家猫5只体重0.5～1kg或1～4kg，用本疫苗的现场使用量，分别0.1ml或1ml口服。免疫户主管理饲养，观察21天。

　　1.1.3.4　病毒分离，将待检唾液标本，以2％小牛血清蒸馏水加压除菌，加入庆大霉素500u/ml，取0.02ml，用7～10日龄的乳鼠进行脑内接种，观察14天 。

　　 1.2　依照《美国动物与动物制品法规—兽医生物制品标准（1991）版》^［4］　按注射用疫苗的方法进行本疫苗的安全试验。

　　1.2.1　疫苗　使用现场用量10倍浓度量1ml/只，免疫接种。

　　1.2.2　动物分组　将20只犬分为4组。即先分为病毒分离组和观察组， 然后每组又分为肌肉注射和隐神经浸润注射组。

　　1.2.2.1　病毒分离组　疫苗接种后，肌肉注射组在第15、20、25、 30和35天；隐神经浸润注射组在第3、6、9、15、30天各淘汰犬一只，剖取局部 淋巴结、脑、肾和唾液腺组织标本，用乳鼠(7～10日龄）脑内注射方法作病毒分离。进行鼠 脑内注射前，采集的组织标本置-70℃保存。对每一窝乳鼠的每只，分别脑内注射0.02ml的 一种磨碎组织的悬液，然后逐日观察21天。若乳鼠发生死亡，则用荧光抗体试验检查脑组 织，以确定乳鼠是否死于狂犬病毒。

　　1.2.2.2　观察组　肌内注射和隐神经浸润注射疫苗后，医学观察90天， 若出现狂犬病临床症状，则立即扑杀，以上述方法采集标本作病毒分离。

　　2　结果

　　2.1　3月龄的10只犬以10倍浓度剂量口服，免疫后1、2、3天连续3 次取唾液进行分离病毒，均为阴性。免疫后6个月没有显示狂犬病任何征象，均健康存活，且发育良好。

　　 2.2　经口服和注射本疫苗的两组各5只黄毛鼠(Rattus losea) ，饲养观察21天，无任何不良反应，并健康存活。

　　 2.3　5只家猫经本疫苗口服免疫后，饲养21天，无任何症状发生，并继续观察150天以上，均健康存活，见表1。

　　 2.4　剖取的局部淋巴结、脑、肾和唾液腺组织分离病毒均为阴性。观察组经肌肉和隐神经及其周围组织浸润注射后，饲养观察90天。无任何狂犬病症状（见表1，2 ）。

表1　不同动物、途径和剂量免疫后医学观察安全试验

表2　注射途径接种犬的病毒分离结果

　　注：-表示阴性3　讨论

　　犬用口服狂犬病减毒活疫苗是一种新的剂型，其特点简便、安全和有效。国外已用于野外的狐狸等。国内用于犬已证明是安全、有效的^［1，2］。此次安全试验以不同动物、不同剂量、不同途径的结果已得到进一步的验证。经用10倍现场使用量的本疫苗给3个月龄的幼犬口服，在免后1，2和3天内采取唾液标本进行病毒分离均未分离出病毒。追踪观察6个月均健康存活。同时用常规剂量对一定数量的猫经口服和对两组野鼠经口服和肌肉注射，在规定的观察时间内均健康生存。另外，在成年犬以10倍现场剂量经肌肉注射和大隐神经及其周围组织浸润注射后，在观察时间内无不良反应。然后在规定时间内剖取颈淋巴结、脑、肾和唾液腺组织标本，以乳鼠脑内接种均未分离出病毒。与上述相同的两个组，经90天的观察期亦均健康存活。

　　犬用口服狂犬病减毒活疫苗毒株的生产材料为11～12g小鼠，脑内接种制备疫苗。本疫苗滴度为LD₅₀＞10^5.5/0.03ml，甚至高达LD₅₀＞10^6.8-7.0/0.03ml，免疫原性好。口服无局部和全身性异常反应。故而是安全的。文献已经证实，口服途径免疫是由疫苗抗原在口腔内接触舌和粘膜实现的^［5］。与口腔抗原递呈细胞(Ant igen presenting cells,APC)对抗原的吞噬和T细胞的活化机制发挥了作用有关。实际上是由膜免疫系统完成的^［6］。因为固定毒不能在唾液腺内增殖^［7］，即使是脑外接种后，固定毒不能侵入脑内，故不能引起发病^［8］。也因为固定毒已经是从野毒株经动物传代派生的，而且已经固定了病毒的生物学性质^［9］，其蛋白氨基酸的分子结构有了改变^［10］。所以固定毒再经细胞传代，进一步减毒的弱毒株的特性和免疫原性已被充分肯定，通过动物试验，已经证明，由街毒变异为固定毒的过程是不可逆的^［11］。

　　本疫苗毒种(CTN-22)是经过一系列的减毒过程派生的弱毒株，经大量的现场实验证实，可以用于犬的口服免疫。口服3天后经唾液和唾液腺组织进行病毒分离均为阴性，说明疫苗毒株不能继续在唾液腺内增殖，进一步证实本疫苗是安全的。

　　4　参考文献

　　1.褚菊仁，严子林，顾悦翔，等.犬用狂犬病口服疫苗的研究.生物制品学杂志，1989 ,2(2):26.

　　2.张汉民，唐学慧，安大华，等.犬用口服狂犬病减毒活疫苗的试验研究.预防医学文献信息 ，1998,4(4):327.

　　3.WHO:Report of WHO consultation on requirements and criteria for field trials o n oral rabies vaccination of dogs and wild carnivores.Geneva.1-2:1989.

　　4.陈光华，译.美国动物与动物制品法规—兽医生物品标准.农业部兽药审评委员会印制，19 91;137.

　　5.岳军明，侯世宽，殷震.狂犬疫苗口服免疫的研究现状.中国人兽共患病杂志，1994,10(3) :32.

　　6.杨廷彬，尹学念主编.实用免疫学，长春出版社，1994;82.

　　7.浙江医科大学传染病学，人民卫生出版社,1983;245.

　　8.董树林主编.常见传染病免疫预防，甘肃科技出版社，1991,270.

　　9.Karl G,Nicholson:Modern Vaccines Rabies.The Lancet,1990,335:1201.

　　10.Foloence Lafay,et al.Vaccination against rabies construction and charac terization of SAG₂,a duble avirulent derivative of SAD_Bern.Vaccine,194,1 2(4):317.

　　11.殷震主编.兽医病毒学，科学出版社，1985,549.

1998年11月14日收稿