强直性脊柱炎患者外周血Th1/Th2淋巴细胞类型

中华风湿病学杂志 2000年第4期第4卷 论著

作者：朱剑　刘湘源　黄烽

单位：朱剑(100853 北京，解放军总医院风湿科)；刘湘源(100853 北京，解放军总医院风湿科)；黄烽(100853 北京，解放军总医院风湿科)

关键词：脊柱炎，强直性；Th1细胞；Th2细胞；三色流式细胞分析法

　　【摘　要】　目的　通过检测强直性脊柱炎患者外周血中CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞分泌细胞因子的情况，探讨T淋巴细胞亚群与强直性脊柱炎发病的关系。方法　建立三色流式细胞分析法对强直性脊柱炎患者和健康志愿者外周血中淋巴细胞的胞内细胞因子(IFNγ、IL-4)和表面抗原(CD4、CD8)进行分析。同时采用夹心酶联免疫吸附法测定血清中IFNγ和IL-4的水平。结果　无论是CD4^＋还是CD8^＋T淋巴细胞，分泌IFNγ的细胞群要比分泌IL-4的细胞群多；IL-4主要由Th2细胞产生，而Th1分泌的IFNγ要比Th2多；患者的Th1或Th2型细胞数与炎症活动指标呈负相关。与对照组相比，强直性脊柱炎患者外周血中Th1和Th2细胞在受刺激后并未增多。患者外周血中IFNγ水平明显升高，而IL-4水平无显著变化；IFNγ水平与炎症活动指标无明显相关性。结论　在强直性脊柱炎患者的外周血淋巴细胞中，以Th1型细胞为主。但Th1细胞在受刺激后分泌细胞因子的能力比Th2细胞低。

Th1/Th2 balance and ankylosing spondylitis

ZHU Jian,LIU Xiangyuan,HUANG Feng.

　　Department of Rheumatology,PLA General Hospital,Beijing 100853,China

　　【Abstract】　Objective　To investigate the pattern of T helper cytokines in the peripheral blood and try to understand the role of T lymphocyte subgroups in the pathogenesis of ankylosing sondylitis (AS).Methods　Three-color flow cytometric analysis was employed for intracellular cytokines (IFNγ,IL-4) and surface antigens (CD4,CD8) of T cells in the peripheral blood of AS patients and healthy volunteers.Sandwich ELISA was used to measure the level of IFNγ and IL-4 in the serum.Results　The positive rates of IFNγ-producing cells among either CD4^＋ or CD8^＋ T cells were significantly higher than those of IL-4-producing cells in the peripheral blood of patients with AS.Although the rates of IFNγ-producing cells among CD4^＋ and CD8^＋ T cells in AS patients did not change compared with the controls,they had a negative correlation with the inflammation index (CRP,ESR and platelet counts).The level of IFNγ was increased while the level of IL-4 was within the normal range,and the IFNγ/IL-4 ratio in the patients was significantly higher than that in the controls.But neither the level of IFNγ nor the IFNγ/IL-4 ratio had any relation with the inflammation index.Conclusion　There is a dominant Th1 subset in the peripheral blood of the AS patients,that is,there is a shift toward T cells with a Th1 cytokine profile.But Th1 cells seem to secrete fewer cytokines after stimulated by PMA/ionomycin than Th2 cells.

　　【Key words】　Spondylitis,ankylosing;　Th1 cell;　Th2 cell;　Three-color flow cytometric analysis

　　目前认为，人类CD4^＋T细胞(即T辅助细胞，Th)可根据产生细胞因子类型的不同分为3个亚型：1型(Th1)、2型(Th2)和3型(Th0)细胞。其中Th1细胞分泌白细胞介素-2(IL-2)、干扰素γ(IFNγ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，最近认为白细胞介素-17(IL-17)亦主要由Th1细胞产生；而Th2细胞分泌白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)和白细胞介素-13(IL-13)。Th细胞在许多免疫反应中发挥着各种作用。Th1细胞主要参与细胞免疫，介导迟发型变态反应，并与器官特异性自身免疫性疾病的发病有关；而Th2细胞主要参与体液免疫反应，激发Ⅰ型变态反应，并有一定的阻止某些自身免疫性疾病进展的能力。CD4^＋T细胞在慢性自身免疫性炎性疾病中发挥着重要作用，如多发性硬化、糖尿病和类风湿关节炎(RA)等^［1］。

　　强直性脊柱炎(AS)是一种慢性炎性疾病，主要侵犯中轴骨骼，以骶髂关节炎为标志。炎性外周关节炎常为病程中的突出表现。另外一种常见的关节炎性疾病—RA与Th细胞的关系已得到广泛研究，但AS与Th细胞群的关系却未受到普遍关注。鉴于此，本文拟通过检测AS患者外周血中CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞分泌细胞因子的情况，探讨T淋巴细胞亚群与AS发病的关系。

　　1　资料与方法

　　1.1　三色流式细胞分析法检测分泌IFNγ和IL-4的CD4^＋、CD8^＋细胞

　　1.1.1　病例选择：14例AS患者为近期收住院病人，均符合美国风湿病协会1986年修订的诊断标准。男性6例，女性8例，年龄17～35岁，平均26岁，病程3个月～11年，平均3.3年。对照组为7名健康志愿者。

　　1.1.2　主要试剂：Cy-chrome标记的抗CD4单抗(鼠抗人IgG₁k；RPA-T4克隆)，Cy-chrome标记的抗CD8单抗(鼠抗人IgG1k；RPA-T8克隆)，PE标记的抗IL-4单抗(鼠IgG2a；MP4-25D2克隆)，FITC标记的抗IFNγ单抗(鼠IgG1；4S.B3克隆)，PE标记的鼠IgG1同种型对照免疫球蛋白(R3-34克隆)，FITC标记的鼠IgG1同种型对照免疫球蛋白(MOPC-21克隆)，Cy-chrome标记的鼠IgG1，κ同种型对照免疫球蛋白(MOPC-21克隆)、细胞内染色试剂盒和红细胞裂解液购自Phar Mingen公司。佛波醇乙酯(PMA)和离子霉素(ionomycin)购自Sigma公司。IMDM培养基和胎牛血清购自Gibco Brl公司。

　　1.1.3　方法：静脉采血1 ml，肝素抗凝。用IMDM培养基按1∶1的体积稀释全血，充分混匀。向稀释血中加入刺激剂PMA(20 ng/ml)、离子霉素(1 μg/ml)和蛋白质转运抑制剂monencin(2 μmol/L)以阻止细胞因子向细胞外分泌。混匀后每200 μl液体分别加入5 ml塑料试管，在37 ℃ 5% CO₂环境中孵育4 h。加入2 ml红细胞裂解液，暗环境中孵育10 min，使红细胞充分裂解。离心5 min，500 g，弃上清。以染色缓冲液清洗1次，离心5 min，500 g，弃上清。对细胞表面抗原进行染色，每管加入20 μl Cy-chrome标记的CD4、CD8或对照单抗，常温孵育15 min。用染色缓冲液清洗1次，离心(500 g)，去除上清。用500 μl PBS/4%多聚甲醛溶液重悬浮细胞20 min。以PBS/1%皂素溶液清洗细胞，使细胞膜出现微孔以利于抗细胞因子单抗进入细胞。离心5 min，500 g，弃上清。细胞内细胞因子染色，每管加入0.2 μg FITC-标记的鼠抗人IFNγ单抗和PE标记的鼠抗人IL-4单抗，室温避光30 min，同时以相应的同种型IgG单抗作对照染色。以PBS/1%皂素溶液清洗一次。500 μl PBS/2%多聚甲醛悬浮细胞。应用流式细胞仪FACScabular，根据前向散射光和侧向散射光以淋巴细胞群设门，对FL1、FL2和FL3通道分别以相应的同种型IgG染色细胞为阴性对照，设置各通道之间的荧光补偿后，对CD4^＋、CD8^＋细胞分泌IL-4和IFNγ的情况进行检测。

　　1.2　夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清IL-4和IFNγ水平

　　1.2.1　病例选择：30例AS患者为近期收住院病人，均符合1984年修订的纽约诊断标准。男性24例，女性6例。年龄19～57岁，平均29.4岁，病程3个月～17年，平均6.8年。清晨采血2 ml，静置取血清备用。对照组为9名健康献血员的正常血清。

　　1.2.2　试剂：人IL-4和IFNγ ELISA试剂盒购自Genzyme公司。

　　1.2.3　检测方法：根据试剂盒上的步骤进行夹心ELISA法检测人血清中的IL-4和IFNγ水平。

　　1.3　统计学处理

　　各项数据采用SAS统计软件进行统计分析。

　　2　结　　　果

　　无论是CD4^＋还是CD8^＋T淋巴细胞，分泌IFNγ的细胞群要比分泌IL-4的细胞群多，即Th1和Tc1型细胞比Th2和Tc2型细胞多(均P＜0.001)；IL-4主要由Th2细胞产生(P＜0.001)，而Th1细胞分泌的IFNγ要比Tc1细胞多(P＜0.001)；同时，患者的Th1和Th2型细胞数与炎症指标［红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CPR)、血小板等］呈负相关，而其他细胞数与炎症指标没有相关性(见表1)。但与对照组相比，强直性脊柱炎患者外周血中Th1和Tc1细胞在受刺激后并未增多(见表2)。

　　同健康志愿者相比，AS患者外周血中IFNγ水平明显升高，而IL-4水平无显著变化；IFNγ水平与炎症活动指标无明显相关性。进一步分析后发现，患者的IFNγ/IL-4的比值较对照组明显升高(见表3)，表明外周血中Th细胞以Th1型为主，但该比值与炎症指标亦无统计学相关性。

表1　外周血Th1 Tc1和Th1/Th2 Tc1/Tc2水平与炎症活动指标的相关性分析

表2　外周血中Th1 Th2和Th0细胞的百分率(%)

表3　强直性脊柱炎患者外周血IFNγ

　　IL-4和IFNγ/IL-4水平pg/ml

　　3　讨　　　论

　　近两年来，运用荧光标记的抗细胞表面抗原和抗细胞内细胞因子单抗，结合短时间固定、破膜打孔处理技术，使检测细胞内细胞因子成为可能^［2-4］。在流式细胞仪下观察单个活细胞内的染色情况，比较不同种类的细胞在细胞内所含细胞因子的浓度以及这种细胞所占百分比。此方法在检测产生细胞因子的不同细胞亚群的同时，还可对单个细胞同时检测两种或更多种细胞因子，从而能在细胞水平上分门别类地了解单个活细胞产生细胞因子的情况。该方法不仅生动直观、省时省力，而且结果可靠、特异性强、敏感性高。我们应用该方法对AS患者外周血中的Th1/Th2细胞因子类型进行了研究，发现刺激剂作用后病人的外周血中Th1细胞百分数以及Th1/Th2比值同正常人相比并无明显差别。但随着炎症指标的升高，受刺激后产生IFNγ的Th1和Tc1细胞数反而减少。

　　进一步采用夹心ELISA法检测AS患者外周血的细胞因子后发现：病人的IFNγ水平明显升高，而IL-4水平则维持在正常水平；IFNγ的升高与临床指标缺乏相关性。本文结果与已发表的少数文献不同。Gratacos等^［5］报道AS患者血清IFNγ水平与正常人无明显差别，而IL-10水平则明显升高，且与病情活动程度相关。导致这种差异的原因不清。由于夹心ELISA法显示Th1型细胞因子增多，可以看出Th1细胞在受刺激后分泌细胞因子的能力较Th2细胞下降了，而且这种分泌能力的下降与AS的炎症活动程度密切相关。

　　多色流式细胞分析术检测细胞内细胞因子的方法已在RA中得到较广泛的应用。Morita等^［6］发现RA滑膜和外周血的T细胞在PMA/离子霉素刺激后产生的细胞因子以IFNγ为主，IL-10也有少量表达；滑液中的CD4^＋细胞产生的IFNγ比外周血中的多。最近Mangge等^［7］观察到RA患者的全血中Th1细胞比正常人明显减少，而Th2细胞变化不明显。其可能原因为Th0/Th1细胞存在分化缺陷，或Th1选择性地进入了受累关节中。这一点与本实验在强直性脊柱炎患者的发现相似，但目前尚未见有关AS患者滑膜中Th细胞类型的研究。本实验室有关幼年AS的研究显示患者滑液中炎性细胞因子的浓度比血清中高出许多，提示细胞因子或产生这些因子的细胞选择性地进入了受累关节中。在成年AS患者中可能也存在Th1细胞由外周血归巢进入滑膜组织的情况，虽然尚不清楚成年和幼年患者的发病机制是否相同。

　　Th1型细胞因子和Th2型细胞因子之间存在错综复杂的关系，如IL-4可促进Th2细胞增生，IL-4、IL-10等分泌增多，同时抑制Th1细胞的活性。IL-12则可激活Th1细胞，对Th2细胞分泌细胞因子有抑制作用^［1］。近期又发现，在不同疾病中，这种相互作用不尽相同^［8］。影响Th1/Th2细胞因子分泌的因素很多。皮质激素和改善病程的药物对T细胞有抑制作用，如甲氨蝶呤可使Th2产生IL-4、IL-10增多。本实验中的患者不可避免地使用了这些药物。由于病例数较少，我们未能具体分析这些药物对Th细胞分泌细胞因子的影响。Brand等^［9］用有丝分裂原植物血凝素和刀豆素A刺激AS患者和正常人外周血细胞后检测细胞增生反应和IFNγ的水平，发现与正常组相比，AS患者IFNγ浓度及细胞增生反应均明显偏低。和Brand的不同，我们在实验中使用的刺激剂为PMA/离子霉素，并未发现患者的T细胞产生IFNγ和IL-4的能力与正常对照有区别。刺激剂的差异可以导致不同的T细胞增生和分泌细胞因子的情况^［3］，这可能是我们得到的结果有差别的原因。

　　Th细胞在关节炎中到底发挥怎样的作用?一般认为，Th1是一种炎症介质，起致病作用，而Th2细胞主要出现于炎症的恢复期，对关节炎有保护作用。Kanik等^［10］观察到：在早期RA的外周血中，同慢性患者相比，IL-2和IFNγ明显增多。随着关节炎的进展，Th1细胞逐渐减少。临床观察到，妊娠时随着雌激素水平的上升，Th1细胞减少而Th2细胞增多，RA患者的关节炎症状常常得到缓解；但在分娩后雌激素水平回到原来水平，Th1细胞则增多，病人的关节炎症状加重^［11］。使用抗CD4单抗治疗RA，患者的病情明显改善，且IL-2和IFNγ水平显著下降。而Masuko等^［12］观察到，Th1/Th2值低的类风湿关节炎患者关节炎活动程度较轻，且对改善病程药物的反应要比Th1/Th2值高的患者好。动物试验发现^［13］，IFNγ在胶原关节炎中起破坏作用，在早期注射抗IFNγ单抗后小鼠的关节炎发病率和程度均下降。使用抗IL-4和IL-10抗体治疗小鼠可使关节炎加重，而使用IL-4和IL-10则可使之减轻。上述证据均表明Th1在关节炎中的致病作用和Th2的保护作用。但Yin等^［8］却发现不同的关节炎中存在截然相反的Th1/Th2细胞因子类型；而且IFNγ基因敲除小鼠的胶原关节非但没有减轻，反而显著加重^［13］。故目前尚不能简单地下结论，认为对于关节炎来讲，Th1细胞一定有益而Th2细胞一定有害。遗憾的是，未见到有关Th1/Th2细胞在AS发病中作用的研究。

　　我们的结果提示：AS患者外周血淋巴细胞以Th1型细胞为主，但Th1细胞的分化能力似较Th2细胞下降，且随着炎症的活动，这种下降更明显。据此推测，AS的发病与Th1型细胞因子增多，而Th2型细胞因子减少有关；但尚不清Th1/Th2细胞群特别是Th1细胞在AS中的确切作用。进一步探讨Th1与Th2细胞的平衡将有助于理解它们在AS发生、发展中的作用，从而为临床治疗提供新的思路。基金项目：国家自然科学基金资助项目 (A39870720)

参 考 文 献

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　　3.Maino VC,Piker LJ.Identification of functional subsets by flow cytometry:intracellular detection of cytokine expression.Cytometry,1998,34:207.

　　4.胡大伟，石学耕，陈顺乐，等.三色流式细胞术检测胞内细胞因子的建立.上海免疫学杂志，1999，19：280.

　　5.Gratacos J,Collado SA,Filella X,et al.Serum cytokines(IL-6,TNFα,IL-1β and IFNγ) in ankylosing spondylitis:a class correlation between serum IL-6 and disease activity and severity.Br J Rheumatol,1994,33:927.

　　6.Morita Y,Yamamura M,Kawashima M,et al.Flow cytometric single-cell analysis of cytokine production by CD4^＋ T cells in synovial tissue and peripheral blood from patients with rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum,1998,41:1669.

　　7.Mangge H,Felsner P,Herrmann J,et al.Early rheumatoid arthritis is associated with diminished numbers of Th1 cells in stimulated peripheral blood.Immunobiology,1999,200:290.

　　8.Yin Z,Braun J,Neure L,et al.Grucial role of interleukin-10/interleukin-12 balance in the regulation of the type 2 T helper cytokine response in reactive arthritis.Arthritis Rheum,1997,40:1788

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　　13.Manoury SB,Chiocchia G,Bessis N,et al.High susceptibility to collagen-induced arthritis in mice lacking IFN-gamma receptors.J Immunol,1997,158:5501.

(收稿日期：1999-12-16)